一、研究背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限为特征的慢性炎症性气道疾病,气流受限不完全可逆,呈进行性发展,与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD在世界范围内是主要的致死原因之一,并导致沉重的经济负担和社会负担。气道重塑是COPD重要的病理学改变之一,主要引起不可逆性气道狭窄及气流受限,其发生的主要原因是反复的损伤与修复。气道重塑是指气道壁的结构改变,在COPD主要表现为气道上皮细胞增生、鳞状细胞和高脚杯细胞化生、基底膜增厚、胶原蛋白沉积、支气管周围纤维化及血管再生。目前,仍然没有有效的治疗方法能阻止或是逆转气道重塑。细胞外基质(ECM)蛋白异常沉积是气道重塑的重要特征之一,在疾病过程中其质和量都发生了不同程度的改变,并能引起持续的组织损伤和气流受限。在COPD患者的气道壁中,ECM蛋白组分的改变包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白表达增加,而核心蛋白多糖表达减少,并且在早期COPD患者的小气道中就已经存在ECM蛋白的改变。ECM蛋白的改变不仅与第一秒用力呼气容积(FEV1)的下降密切相关,还会影响气道对于治疗药物的反应性。长期以来,ECM蛋白被认为主要是由成纤维细胞产生的,但近年来研究发现,气道平滑肌细胞(ASMC)除了具有收缩和舒张作用,还具有合成功能。更重要的是,有学者发现,支气管收缩产生的机械力量能够引起包括ECM蛋白沉积在内的气道重塑改变,并且独立于气道炎症。同时,越来越多的研究也开始关注到支气管舒张剂的抗气道重塑作用。噻托溴铵作为一种长效抗胆碱能药物,除了支气管舒张作用外,还具有抑制气道重塑的作用,然而,其作用机制却研究甚少。细胞的收缩和舒张与细胞骨架的重构有关,其中,β-连环蛋白在其中具有特殊的作用:当它作为一种膜结合蛋白,在细胞粘合连接处将钙粘蛋白与细胞骨架相连,发挥稳定细胞和传导机械力量的作用;而胞浆中游离的β-连环蛋白,是Wnt/β-连环蛋白信号通路中重要的中心物质。β-连环蛋白一方面与细胞结构相连,感受力学信号,另一方面又是Wnt/β-连环蛋白信号通路的重要蛋白,参与ECM蛋白基因转录。综上所述,我们提出研究假设:噻托溴铵通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路而减少乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白的表达。二、研究目的1.探讨长效抗胆碱能药物噻托溴铵对乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的抑制作用。2.探讨Wnt/β-连环蛋白信号通路在噻托溴铵抑制乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达中的作用。三、研究方法(一)人气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.原代培养:取胸外科肺叶切除术患者的手术标本,采用组织块贴壁法进行原代培养。用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养细胞。第2~10代细胞用于后续实验。2.细胞鉴定:采用免疫荧光方法对所培养的细胞进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链(MHC)特异性染色,在荧光倒置显微镜下观察荧光表达,以鉴定其是否为平滑肌细胞。3.加药刺激:将细胞接种于35mm/60mm培养皿中,待细胞生长至占培养皿底面积70~80%时,饥饿细胞12h,加药刺激,噻托溴铵先于乙酰甲胆碱30min加入。刺激结束后,收集细胞,用于后续实验。(二)Western Blot1.细胞总蛋白和核蛋白提取:使用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液提取细胞总蛋白;使用核浆蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白上样体积。2.Western Blot:按照标准方法进行。样品上样量在15~25ug之间,采用10%SDS-PAGE凝胶电泳,再将蛋白转至0.22um的PVDF膜上。用5%BSA封闭2h,一抗4℃过夜。再常温孵育HRP标记的二抗1h。最后,采用化学发光法检测蛋白表达量。3.灰度值测量:采用Image J软件测量条带灰度值,以β-actin或Lamin B1作为内参,计算目的蛋白条带与内参条带的灰度值之比,用来表示目的蛋白的表达水平。(三)实时荧光定量PCR1.细胞总RNA提取及逆转录:使用Mini BEST Universal RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,用Nano Drop Spectrophotometer测量RNA浓度。用逆转录试剂盒将1ugm RNA逆转录为c DNA。置于-20℃保存。2.实时荧光定量PCR:将SYBR Premix Ex Taq II、特异性引物及c DNA混合,采用罗氏480机器进行实时荧光定量PCR。3.数据分析:以GAPDH作为内参基因,读取各组CT值,计算2-△△CT值,用以表示目的基因的相对表达量。(四)转染过表达β-连环蛋白的腺病毒1.病毒转染:将细胞接种于六孔板中,用含10%胎牛血清的DMEM培养细胞。待细胞生长至占孔底面积50%时,转染腺病毒(MOI=100),48h后在荧光倒置显微镜下观察荧光强度,以代表转染效率。2.后续处理:转染结束后,加药刺激,噻托溴铵先于乙酰甲胆碱30min加入。刺激24h后,收集细胞,用于提取细胞总蛋白和总RNA。(五)转染小干扰RNA1.转染方法:将细胞接种于六孔板中,用含10%胎牛血清的DMEM培养细胞。待细胞生长至占孔底面积50%时,换成无血清培养基,使用Lipofectamine2000进行转染。小干扰RNA转染浓度为90n M。转染6h后,再次更换培养基为含10%胎牛血清的DMEM,继续培养42h。2.后续处理:转染结束后,加药刺激,噻托溴铵先于乙酰甲胆碱30min加入。刺激24h后,收集细胞,用于提取细胞总蛋白和总RNA。(六)ELISA按照试剂盒说明进行实验。(七)统计分析所有数据均为计量资料,数值均以均数±标准差(`x±s)表示,采用SPSS16.0统计软件。两组比较采用独立样本t检验。进行多组间总体均数比较,若方差齐采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时,方差齐采用SNK法检验,方差不齐采用Dunnett’s T3法检验。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。四、实验结果(一)人气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.原代培养约2~3周后,光镜下观察可见平滑肌组织块周围陆续有短梭形的细胞爬出,继续生长1周左右,相邻组织块周围的细胞开始发生融合。细胞生长融合后呈典型的“谷峰征”。2.细胞免疫荧光染色,细胞α-SMA和MHC表达阳性,可鉴定为平滑肌细胞。(二)乙酰甲胆碱对人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的作用1.不同浓度乙酰甲胆碱对Ⅰ型胶原蛋白表达的影响:与对照组相比,1u M和10u M均可引起人ASMC表达Ⅰ型胶原蛋白增加,差异有统计学意义(分别为P<0.01,P<0.001),并在10u M增加明显。后续实验乙酰甲胆碱的刺激浓度均为10u M。2.乙酰甲胆碱刺激不同时间对Ⅰ型胶原蛋白表达的影响:与对照组相比,从刺激后2h开始,Ⅰ型胶原蛋白的表达量开始增加,至24h达最大,48h开始下降,差异有统计学意义(P<0.001)。后续实验刺激时间采用24h。3.乙酰甲胆碱对多种ECM蛋白m RNA表达的影响:乙酰甲胆碱能引起Ⅰ型胶原蛋白(P<0.001)、纤维连接蛋白(P<0.001)、多功能蛋白聚糖(P<0.001)、层粘连蛋白α2(P<0.01)m RNA表达量增加,而核心蛋白多糖m RNA表达量减少(P<0.01),差异有统计学意义。(三)噻托溴铵抑制乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达1.不同浓度噻托溴铵对Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用:噻托溴铵在10u M、100u M浓度时可明显抑制乙酰甲胆碱引起的Ⅰ型胶原蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05),且在10u M和100u M浓度的抑制作用相似。后续实验噻托溴铵的刺激浓度采用10u M。2.噻托溴铵抑制多种ECM蛋白m RNA的表达:噻托溴铵能够明显抑制乙酰甲胆碱引起的Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、多功能蛋白聚糖m RNA表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.001)。(四)噻托溴铵对Wnt/β-连环蛋白信号通路的抑制作用1.噻托溴铵对总β-连环蛋白表达的抑制作用:噻托溴铵从10u M开始明显抑制乙酰甲胆碱引起的总β-连环蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05),100u M噻托溴铵的抑制作用与10u M相似。2.噻托溴铵对β-连环蛋白m RNA表达的抑制作用:噻托溴铵能够明显抑制乙酰甲胆碱引起的β-连环蛋白m RNA表达,差异有统计学意义(P<0.05)。3.噻托溴铵对活化的β-连环蛋白表达的抑制作用:噻托溴铵从10u M开始明显抑制乙酰甲胆碱引起的活化的β-连环蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05),100u M噻托溴铵的抑制作用与10u M相似。4.噻托溴铵对GSK3β磷酸化的抑制作用:噻托溴铵能够明显抑制乙酰甲胆碱引起的GSK3β磷酸化,差异有统计学意义(P<0.05)。(五)噻托溴铵对活化的β-连环蛋白核转位的抑制作用1.噻托溴铵对活化的β-连环蛋白表达的抑制作用:噻托溴铵能够明显抑制乙酰甲胆碱引起的活化的β-连环蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。2.噻托溴铵对活化的β-连环蛋白核转位的抑制作用:噻托溴铵能够明显抑制乙酰甲胆碱引起的细胞核内活化的β-连环蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。(六)过表达β-连环蛋白对噻托溴铵抑制乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的影响1.转染最佳MOI值:在MOI=100时,绿色荧光明显增强,MOI=200时的绿色荧光强度与MOI=100时相近。后续实验均采用MOI=100。2.转染效率检测:实时荧光定量PCR结果显示,细胞内β-连环蛋白m RNA水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.001);Western Blot结果显示,与阴性对照组(NC)相比,细胞内总β-连环蛋白表达明显增加。3.过表达β-连环蛋白后,噻托溴铵对活化的β-连环蛋白表达的抑制作用:与阴性对照组(control-NC)相比,乙酰甲胆碱组(Mch-NC)能够引起活化的β-连环蛋白表达增加;转染过表达腺病毒后(control-S33Y组),活化的β-连环蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与(Mch-NC)组相比,噻托溴铵组[(Mch+Tio)-NC]降低了活化的β-连环蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);转染过表达腺病毒后,乙酰甲胆碱组(Mch-S33Y)能够明显增加活化的β-连环蛋白表达,且噻托溴铵组[(Mch+Tio)-S33Y]并不能降低活化的β-连环蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,(Mch-S33Y)组和[(Mch+Tio)-S33Y]组中活化的β-连环蛋白表达量均高于(control-S33Y)组,差异有统计学意义(P<0.05),而(Mch-S33Y)组与[(Mch+Tio)-S33Y]组无明显差异。4.过表达β-连环蛋白后,噻托溴铵对Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用:与阴性对照组(control-NC)相比,乙酰甲胆碱组(Mch-NC)能够引起Ⅰ型胶原蛋白表达增加;转染过表达腺病毒后(control-S33Y组),Ⅰ型胶原蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与(Mch-NC)组相比,噻托溴铵组[(Mch+Tio)-NC]降低了Ⅰ型胶原蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);转染过表达腺病毒后,乙酰甲胆碱组(Mch-S33Y)能够明显增加Ⅰ型胶原蛋白的表达,且噻托溴铵组[(Mch+Tio)-S33Y]并不能降低Ⅰ型胶原蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,(Mch-S33Y)组和[(Mch+Tio)-S33Y]组中Ⅰ型胶原蛋白表达量均高于(control-S33Y)组,差异有统计学意义(P<0.05),而(Mch-S33Y)组与[(Mch+Tio)-S33Y]组无明显差异。(七)沉默β-连环蛋白对噻托溴铵抑制乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的影响1.转染效率检测:与阴性对照组(control-NC)相比,细胞内β-连环蛋白m RNA的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.沉默β-连环蛋白后,噻托溴铵对总β-连环蛋白表达的抑制作用:与阴性对照组(control-NC)相比,乙酰甲胆碱组(Mch-NC)能够引起β-连环蛋白表达增加;转染β-catenin-si RNA(control-si RNA组)后,β-连环蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与(Mch-NC)组相比,噻托溴铵组[(Mch+Tio)-NC]降低了β-连环蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);转染β-catenin-si RNA后,乙酰甲胆碱组(Mch-si RNA)引起的β-连环蛋白的表达量也降低,差异有统计学意义(P<0.05),且[(Mch+Tio)-si RNA]组β-连环蛋白的表达量降低更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。3.沉默β-连环蛋白后,噻托溴铵对Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用:与阴性对照组(control-NC)相比,乙酰甲胆碱组(Mch-NC)能够引起Ⅰ型胶原蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与(Mch-NC)组相比,噻托溴铵[(Mch+Tio)-NC]降低了Ⅰ型胶原蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);转染β-catenin-si RNA后,乙酰甲胆碱组(Mch-si RNA)Ⅰ型胶原蛋白的表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05),且[(Mch+Tio)-si RNA]组Ⅰ型胶原蛋白的表达量降低更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(八)噻托溴铵对ECM蛋白分泌的影响与对照组相比,乙酰甲胆碱组(Mch)并没有增加纤维连接蛋白的分泌量,差异无统计学意义(P>0.05);与乙酰甲胆碱组(Mch)相比,噻托溴铵组(Mch+Tio)也并未降低纤维连接蛋白的分泌量,差异无统计学意义(P>0.05)。五、结论噻托溴铵通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路而减少乙酰甲胆碱诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白合成,但并不能抑制纤维连接蛋白的分泌。