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黄酮类化合物是一种在植物体内广泛存在的多酚类化合物,近年来由于其在营养和临床上展现出来的功效使其受到越来越广泛的关注。在自然条件下,植物为了更好地适应环境,获得更大的生存机会,其体内的亲脂性小分子会发生糖基化。黄酮类化合物的糖基化是植物抵御异物入侵和液泡中储存生物活性物质的作用机制。黄酮化合物的糖基化反应一般由糖基转移酶(Glycosyltransferase,GT)催化完成。O-糖基转移酶(Oxygen Glycosyltransferase,OGT)催化的O-糖基化与C-糖基转移酶(CarbonGlycosyltransferase,CGT)催化的C-糖基化的过程有所不同,黄酮化合物的O-糖基化是在OGT的催化下,将糖基直接连接到黄酮类化合物的O-3位点或O-7位点上,而在对荞麦中的黄酮类化合物的C-糖基化研究中发现,黄酮类化合物的C-糖基化需要先在细胞色素P450的作用下形成黄酮的衍生物——2-羟基黄烷酮,然后由CGT催化2-羟基黄烷酮的C-6或C-8位点发生糖基化,再经脱水反应完成C-糖基化的过程。目前植物中己经成功解析出晶体结构的黄酮类化合物的糖基转移酶只有六种,分别来自苜蓿、葡萄、蝴蝶豆和拟南芥,且全部都为OGT。目前的研究显示OGT与CGT在功能上具有显著的差异,却不清楚产生这种差异的分子机制。蛋白质的结构决定其功能,只有解析出CGT的晶体结构才能从分子层面了解CGT催化机制,进而比较CGT与OGT结构与功能上的差异。本实验的研究对象为禾本科的模式植物水稻(Oryza sativa L.)同源的三种CGT基因OsCGT1、OsCGT2、OsCGT3和另一种禾本科模式植物二穗短柄草(Brachypodium distachyum)同源的两种 CGT 基因 BdCGT1、BdCGT2。用这五种基因分别与表达载体pET-28b-sumo,pET-28b-3C,pGEX-6p-1构建重组载体。用构建成功带有目的基因的重组表达载体大量表达带标签的目的蛋白。然后用亲和层析、离子交换树脂层析和凝胶过滤层析的方法纯化目的蛋白OsCGT1、OsCGT2、OsCGT3、BdCGT1、BdCGT2。结果显示融合蛋白 OsCGT1、OsCGT2、OsCGT3、BdCGT1带sumo标签时纯化效果较好,BdCGT2带6*His标签时纯化效果较好。用Hampton Resaerch公司和Emerald BioSystems公司的晶体初筛试剂盒对纯化出的OsCGT1、OsCGT2、OsCGT3、BdCGT1、BdCGT2进行蛋白质晶体的初筛与优化,筛选出BdCGT1、BdCGT2蛋白质的结晶条件,其中BdCGT2蛋白质晶体通过上海同步辐射光源获得的衍射数据,并成功解析出分辨率为2.5 A晶体结构。将本研究中的五种蛋白质与部分已经鉴定出功能的OGT以及CGT进行氨基酸序列比对,结合现在己有的研究,提出了造成CGT功能有别于OGT的关键氨基酸残基的猜想。本文为研究植物中CGT的结构、功能、催化机制以及基因改造提供了理论依据。