背景扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)是最常见的原发性心肌病,具有预后差,病死率高的特点,且发病逐年增长,严重威胁人类的健康。心室重构(Ventricular remodeling,VR)是引起DCM心力衰竭的主要病理基础,而抑制或逆转心室重构是DCM治疗的关键。心室重构机制复杂,与神经-体液调节、细胞凋亡、炎症因子等因素密切相关。细胞凋亡是心脏重构最重要的机制之一。它与心力衰竭的发生发展密切相关,抑制心肌细胞凋亡可以减轻心脏重构,改善心功能。近年来,在经典的线粒体途径和死亡受体凋亡途径以外,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路的发现,为细胞凋亡提供了新的信号途径。研究认为通过抑制过度的ERS反应,可以减轻心肌细胞凋亡,并因此达到改善和逆转心室重构的目的。中医药对DCM有丰富的理论研究和治疗经验,具有多途径、多环节、多靶点、安全有效的治疗特点,为DCM的现代治疗提供新的方向。黄芪保心汤是张培影教授根据中医基础理论,结合多年临床经验研发的经验方,临床应用多年疗效显著。前期临床研究表明其可改善DCM患者心功能及预后,抑制患者心肌纤维化,并通过初步基础实验验证其抗心肌纤维化的作用机制。鉴于前期的临床及基础工作,设想黄芪保心汤能抑制神经内分泌系统激活,逆转DCM心室重构的发生,且其分子作用机制可能与其抑制ERS介导心肌细胞凋亡相关。因此本研究采用阿霉素造模建立DCM大鼠模型,探索黄芪保心汤抑制神经内分泌因子、改善DCM大鼠心室重构的作用,并从ERS介导的细胞凋亡途径入手,探讨黄芪保心汤改善DCM大鼠心室重构的分子机制。同时采用血清药理学和血清药理化学的方法,以大鼠为含药血清的供体,以体外原代培养的乳鼠心肌细胞作为研究的对象,通过给予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导,建立心肌细胞凋亡模型,研究黄芪保心汤含药血清对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡及ERS相关凋亡蛋白的影响,从细胞层面探讨黄芪保心汤通过抑制ERS介导细胞凋亡达到抑制心室重构的分子机制。本研究分为以下四个部分:实验一:黄芪保心汤改善DCM大鼠心室重构作用的研究目的:验证黄芪保心汤抑制RAAS系统激活,改善DCM大鼠心室重构的作用方法:通过对90只SD大鼠腹腔注射阿霉素(2.5 mg/kg,每周1次,共8次)建立DCM模型,彩超验证后成模共计55只,随机分组给药如下:模型组(等量无菌水)、黄芪保心汤低、中、高剂量组(分别予5.67g、11.34g、22.68g生药/kg),卡托普利组(6.75 mg/kg),每组11只,每天灌胃给药1次,连续4周。另设正常对照组大鼠10只(等量无菌水灌胃)。4周后,超声心动图检测左室结构及功能变化;颈动脉插管检测血流动力学指标;观察心脏大体形态并称重测心重指数;通过HE染色、Masoon染色观察心肌组织形态学改变;ELISA法检测血清N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、基质裂解素2(ST2)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、肾素活性(Renin)水平;考马斯亮兰法测定心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,脂质过氧化物丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:与正常组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD增高,EF、FS及SV值降低(P<0.01);LVDP、±dp/dtmax减低,LVEDP升高(P<0.01);心脏形态变大,心重指数增大(P<0.01);心肌细胞排列紊乱,大量纤维组织增生;血NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD水平均升高(P<0.01);SOD水平降低,MDA、LDH升高(P<0.01)。与模型组比较,黄芪保心汤低、中、高剂量组可不同程度地降低大鼠LVEDD、LVESD,升高 EF、FS、SV 值(P<0.05,P<0.01);升高 LVDP、±dp/dtmax,降低 LVEDP(P<0.05,P<0.01);降低HWI和LVMI(P<0.05,P<0.01);心肌细胞排列整齐,纤维组织增生减轻;使血 NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD 水平不同程度下降(P<0.05,P<0.01);降低MDA和LDH,并升高SOD水平(P<0.05,P<0.01)。低、中、高剂量组呈一定的剂量-效应关系,高剂量组最优,结果与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。结论:黄芪保心汤可改善扩张型心肌病大鼠心脏扩大、纤维化增生及心功能,通过调控氧化因子、抑制RAAS系统神经内分泌因子激活,改善心功能,抑制心室重构。实验二:黄芪保心汤抑制DCM大鼠内质网应激细胞凋亡机制的研究目的:验证黄芪保心汤抑制DCM大鼠内质网应激细胞凋亡的作用机制。方法:本研究采用实验一中保存的各组组织标本,通过TUNEL染色,检测组织心肌细胞的凋亡水平,予免疫组化法和Western blotting法,检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达水平,并予Western blotting检测ERS分子伴侣GRP78及下游CHOP、Caspase-12凋亡通道蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组心肌细胞凋亡水平明显增加(P<0.01);组织中促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达增加,而抗凋亡因子Bcl-2降低(P<0.05);而心肌组织中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表达水平增加(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组黄芪保心汤可不同程度地降低心肌细胞凋亡水平(P<0.05.,P<0.01);但低剂量组对凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3无明显改善(P>0.05),中、高剂量组可明显降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达水平,升高抗凋亡因子Bcl-2的表达水平(P<0.05);低剂量组对心肌组织中的GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表达水平无明显改善(P>0.05),中、高剂量组可不同程度降低心肌组织中ERS分子伴侣GRP78和Caspase-12、CHOP凋亡通道蛋白的表达(P<0.05),各剂量组结果呈一定的剂量-效应关系,高剂量组最优,结果与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。结论:阿霉素诱导DCM模型大鼠中存在ERS介导细胞凋亡的发生,而黄芪保心汤可能通过抑制ERS,降低分子伴侣GRP78的蛋白表达,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路蛋白表达,而上调Bcl-2表达,下调Bax表达,同时下调Caspase-3蛋白表达而起到抑制心肌细胞凋亡作用。实验三:黄芪保心汤含药血清对AngⅡ诱导内质网应激心肌细胞凋亡的影响目的:验证黄芪保心汤含药血清抑制AngⅡ诱导内质网应激心肌细胞凋亡的作用。方法:1.原代培养乳鼠心肌细胞及鉴定。对新生乳鼠进行体外心肌细胞的原代培养,予台盼兰活力检测,并予形态学及α-actin染色鉴定。2.建立AngⅡ诱导凋亡心肌细胞模型。予不同浓度AngⅡ、不同时间培养,并对培养后的心肌细胞TUNEL染色,检测出TUNEL染色中阳性细胞比例最高的实验条件,并以该条件卜的AngⅡ浓度和培养时间作为本实验最适浓度和最佳时间,进行造模。3.黄芪保心汤含药血清的制备方法及体系中血清添加量的确定。正常SD大鼠黄芪保心汤浓缩液灌胃给药,每日2次,连续给药7天,于末次给药后采血。无菌条件下分离血清,滤过后冻存。通过MTT法细胞活性检测确定体系中最佳空白血清添加量。HPLC法确定给药后最佳采血时间。SD大鼠灌胃,据末次给药后间隔时间分组取血,检测不同采血时间点含药血清的HPLC色谱图,以"归一化法"记录各时间点色谱峰的总面积,通过对不同采血时间点色谱图总面积的计算比较,最后确定最佳采血时间。4.黄芪保心汤含药血清的制备及分组。32只雄性SD大鼠,随机分成4组,每组8只。分别为空白血清组、低剂量含药血清组(28.25 g/kg)、中剂量含药血清组(56.5 g/kg)及高剂量含药血清组(113 g/kg)。各给药组按照相应剂量分别灌胃给药,空白对照组给予相同体积的无菌水,连续7天,每天2次。在末次给药后60 min,对大鼠进行下腔静脉采血,无菌制备空白血清及黄芪保心汤低、中、高剂量组含药血清。5.体外原代培养并鉴定的心肌细胞,分7组分别为:正常对照组、空白血清组、AngⅡ组、低、中、高剂量含药血清组和卡托普利组,后5组予上条件下AngⅡ诱导的凋亡心肌细胞。上7组培养24 h后,采用Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测各组细胞凋亡水平,并通过Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bc1-2、Bax及Caspase-3的表达水平,同时予Western blotting法检测ERS分子伴侣GRP78、相关凋亡通道蛋白Caspase-12和CHOP等的蛋白表达。结果:1.心肌细胞培养成功,台盼兰染色法检测细胞活力≥90%,α-actin染色鉴定显示心肌细胞阳性率≥95%。本实验AngⅡ造模最佳浓度为10-7 mol/L,最佳时间为24 h。TUNEL示凋亡比例最高。2.体系中加入血清的最佳比例为20%,该条件下血清对乳鼠心肌细胞正常活性基本无明显影响。HPLC法确定按人临床用药等效剂量的5倍,每日两次、连续7天灌胃给药,于末次给药60 min时采血所得的含药血清中成分的总峰面积最大。3.与正常对照组比较,空白血清组心肌细胞凋亡水平、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12和CHOP变化均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,AngⅡ组心肌细胞凋亡水平明显增加(P<0.01);促凋亡因子Bax和Caspase-3蛋白表达增加,抗凋亡因子Bcl-2降低(P<0.05);ERS相关凋亡因子GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表达增加(P<0.05)。与AngⅡ组相比,低、中、高剂量组含药血清可不同程度降低细胞凋亡水平(P<0.01);但低剂量组对 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12 和 CHOP 的蛋白表达水平无明显改善(P>0.05),而中、高剂量组可明显降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达,上调抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达(P<0.05);降低GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表达水平(P<0.05)。上述作用呈一定的剂量依赖性,高剂量组与阳性药物卡托普利组无统计学差异。(P>0.05)结论:AngⅡ可诱导ERS介导细胞凋亡的发生,而黄芪保心汤可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡。其机制可能是通过抑制ERS,降低分子伴侣GRP78表达水平,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路,进而上调Bcl-2表达水平,降低Bax、Caspase-3的蛋白表达而起到抑制心肌细胞凋亡作用。