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鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种具有明显种族和地区分布特征的上皮源性头颈部恶性肿瘤。其病因涉及到遗传因素、EB病毒的感染、饮食和某些环境中的化学致癌物的作用等。鼻咽癌的发生是一个多因素多步骤的病理过程,研究发现数十个与鼻咽癌相关的基因,其中抑瘤基因的失活更为普遍,如位于染色体3p21-3区的RASSF1A、BLU、LTF、LARS2、SEMA3B、SEMA 3F和GNAT1等候选抑瘤基因与鼻咽癌发生密切相关。本所对湖南鼻咽癌高发家系进行连锁分析,发现染色体3p21部分区域与湖南家族性鼻咽癌发病紧密连锁。有研究证实在我国南方,正常鼻咽上皮和鼻咽癌前病变以及鼻咽癌组织存在3p染色体（包括3p21.3）丢失,这有力地证明染色体3p21.3区抑瘤基因的功能失活为鼻咽癌发生发展中的早期事件。NPCEDRG基因是我们实验室采用基因定位候选克隆策略获得的一个在正常鼻和鼻咽癌组织表达差异具有显著性的基因,定位于染色体3p21-3,该点存在于湖南家族性鼻咽癌的遗传易感区3p21.31-21.2区域内。我们前期研究结果表明,NPCEDRG在部分鼻咽癌细胞系、鼻咽癌组织中表达下调,过表达NPCEDRG基因可抑制鼻咽癌细胞增殖和细胞周期进程,并部分逆转CNE2的恶性表型,提示NPCEDRG基因可能为个鼻咽癌候选抑瘤基因。为了揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,更深入地阐明NPCEDRG基因的生物学功能,本研究应用生物信息学对候选抑瘤基因NPCEDRG基因进行全面分析,应用5’-Race及3’-RACE及RT-PCR等技术对其选择性剪接变异体进行了探讨,并对预期的蛋白异形体进行了氨基酸序列的推导和功能预测。应用生物信息学预测NPCEDRG基因的启动子区域及转录因子结合位点,成功克隆了其5’-端启动子区域,并利用缺失突变,报告基因、转染技术对该该基因启动子区域进行初步鉴定,应用电泳迁移阻滞分析实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）的分析顺式作用元件。以期明确NPCEDRG基因在鼻咽癌发生机制中的功能提供一些线索。[NPCEDRG基因结构及同源性分析]人NPCEDRG基因定位于湖南家族性鼻咽癌的遗传易感区3p21.31-21.2区域内,其基因全长为6992 bp,由于剪接方式不同形成至少9种mRNA剪接变异体,编码至少3种不同的蛋白质。利用比较基因组学分析发现人NPCEDRG基因与黑猩猩、猕猴、狗、牛及小鼠等5种动物高度同源,说明NICN1基因是一个比较保守的基因。[生物信息学预测NPCEDRG基因表达调控元件]利用多种生物信息学软件对NPCEDRG基因5’-端上游调控区-3500～+500bp区域进行分析。该区域存在2个CpG岛,分别位于-1573～-960bp和-624～+265bp,其中-624～+265bp区域包含所有剪接变异体的第一外显子及约600 bp的5’末端上游调控序列,提示该区域可能为NPCEDRG基因的启动子区域并且在基因表达过程中起重要的调控作用。NPCEDRG基因可能有多个TSS位于-225 bp～+137 bp区间,主要介于ATG上游-99 bp～-17 bp区间。Gene2promoter软件分析TSS位于-73bp和-49 bp处,启动子介于-624 bp～+75 bp。PromoterInspector未预测到任何启动子区。综合分析各软件预测结果,初步确定NPCEDRG启动子区可能介于-624 bp～+75 bp区间。选取人类NICN1基因5’末端上游调控区（-625bp～+250bp）875bp序列,采用Matlnspector V2.2软件和TESS软件搜索转录因子结合位点。如图1-7所示,均未检测到经典的TATA保守序列,但包含CCAAT、SP1、AP1、AP2、STAT1、c-Myb、AREB6、Nkx2-5、ZF5、E2F1、CREBP1和RBPJK等重要调控元件。利用在线程序ECR Browser进行系统发育进化足迹分析,结果显示在人和小鼠等6物种间在-180 bp～+240 bp区间约420 bp序列高度保守,该保守区域中存在包括CCAAT, STAT1和SP1/SP1Q2/SP1Q6/E2FQ2/ZF5/CACD等转录因子结合位点。这些预测结果为进一步鉴定NPCEDRG基因的启动子区及其调控元件,为探讨其表达调控机制奠定了基础。[NPCEDRG基因在肿瘤细胞中的表达检测及mRNA剪接变异体分析]利用RT-PCR检测11种鼻咽癌细胞及4种其他肿瘤细胞中NPCEDRG基因总体mRNA和AF538150 mRNA的表达情况,结果显示NPCEDRG基因总mRNA表达在HK1和6-10B细胞中非常低,在其他细胞中表达相对较高；而AF538150 mRNA在HNE1、HNE2、HNE3、C666-1、HK1、HONE1、5-8F、6-10B、915及A549细胞中表达非常低,而在CNE1、CNE2、NP69、MCF7、HeLa及HL60细胞中其表达相对较高。利用5’-RACE、3’-RACE和RT-PCR在CNE2细胞中进行各种剪接变异体克隆、鉴定,结果发现至少有7种剪接变异体,编码分别由213、171和98个氨基酸组成的蛋白质。NPCEDRG基因至少有7个转录起始位点,分别位于起始密码子ATG上游-95nt、-85 nt、-58 nt、-52 nt、-25nt、-22 nt及-19 nt,其中NM032316的TSS位于ATG上游-85 nt处、AF538150和AK094248的TSS位于-25 nt处。证实AF538150不存在第2外显子中6核苷酸序列（5’-TTGCAG-3’）的缺失,其CDs为516 bp,编码一种由171个氨基酸组成的蛋白质（而非GenBank中公布的CDs为510 bp,一种由169个氨基酸组成的蛋白质）。成功克隆得到一种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CDs为297 bp,编码—种由98个氨基酸组成的蛋白质,其分子量为10.4 kD,等电点为7.1。[NPCEDRG基因启动子的克隆、鉴定及其调控元件的初步分析]依据生物信息学分析结果,构建一系列5’-或3’-端缺失的启动子片段Luc报告基因载体。瞬时转染至MCF7. HeLa和CNE2三种细胞中,荧光素酶活性分析结果表明NPCEDRG基因5’-端调控区-1180～-8 bp区间各Luc报告基因质粒均有较强启动子活性,其中pGL3-en617的荧光素酶活性最强,约为pGL-contral的33.46-52.34%,提示-625～-8 bp区间为最佳的启动子区域；pGL3-en138的荧光素酶活性约为pGL-contral的15.80-21.12%,表明-146～-8 bp区间为NPCEDRG基因的基础启动子区域。在-1180～-8 bp区间相邻各区段启动子活性比较发现,pGL3-en207与pGL3-en617比较启动子活性降幅最大,在三种细胞中分别达到40-45%,因此,我们推测在NPCEDRG基因5’-端调控区-625～-216 bp区间可能存在增强其启动子活性的调控元件进一步构建pEGFP-en617. pEGFP-en207及PEGFP-en138等启动子区EGFP报告基因载体并转染至MCF7细胞中,荧光显微镜直接观察及Western Blot检测EGFP蛋白表达,与Luc报告基因载体荧光素酶活性测定结果基本吻合,再次确证NPCEDRG基因5’-端调控区-625～-8 bp区间为NPCEDRG基因的最佳启动子区,-146～-8 bp区间为其基础启动子区。生物信息学分析结果提示NPCEDRG基因启动子为不含TATA,含有CCAAT盒及GC富集区,可能存在CCAAT/NFY, STAT1和SPl等转录因子结合位点。凝胶电泳迁移率阻滞分析（EMSA）初步确定CCAAT/NF-Y转录因子结合位点参与了NPCEDRG基因的表达调控。