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【研究背景及目的】原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,不但发病率高,位居全球第六位,还包括多种类型,如肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocellular carcinoma,CC)或混合癌。临床数据显示,不同类型肝癌临床预后不同,如CC或混合癌的恶性程度远比HCC更高,而且同种类型肝癌的病理分型不同,预后也不同,这种临床特点与肿瘤异质性密切相关,因此研究肿瘤异质性的发生发展机理成为近年来研究肿瘤的重要关注点。目前有关肝癌起源的问题仍存在争议。越来越多研究表明,慢性肝损伤是导致肝癌发生的重要病理过程。病毒感染、高脂饮食、过量饮酒、胆汁淤积等诱因都可以引起慢性肝损伤。这一过程中不仅有大量肝细胞凋亡坏死,还有炎症贯穿始终,肝前体细胞(Hepatic Progenitor cells,HPCs)也往往被激活并参与损伤修复,而无法顺利修复的持续性损伤最终导致肝癌发生,但炎症是如何参与HPCs异变成瘤,并参与肝癌异质性的,至今仍无定论。作为炎症相关性疾病,从慢性肝损伤直至肝癌发生发展,炎症贯穿始终。炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)在其中的作用一直被研究人员所关注。TNF-α被证实不但可以促进肝癌发生、生长、侵袭及转移,还与临床肝癌病人预后密切相关。但TNF-α影响慢性肝损伤甚至肝癌发生发展的研究往往局限于某个特定阶段,其中作用机制也有诸多不明之处。随着对肝癌研究的不断深入,越来越多的研究表明HPCs在肝脏损伤修复和肝癌发生中发挥重要作用。激活的HPCs既可以正常分化为肝细胞或胆管细胞以修复损伤组织,也有可能异常分化导致肝癌发生,但目前有关TNF-α诱导HPCs异常激活的机制仍不明确。许多报道显示,炎症因子不但影响HPCs的激活,还参与调控HPCs分化方向。因此,探索TNF-α对肝癌发生过程的影响并关注其中HPCs激活、分化的变化及其作用机制,不仅可以深入了解炎症影响肝癌发生及肝癌异质性的本质,还可为进一步的干预提供理论指导。本课题我们采用DEN诱导大鼠肝癌发生模型,在肝癌发生过程中给予不同剂量的TNFR2-Fc融合蛋白变异体(A variant of TNFR2-Fc fusion protein,TNFR2-Fc V)以影响大鼠体内TNF-α浓度,并采用Tnfα-/-大鼠进行DEN诱癌,观察TNF-α浓度的改变对大鼠肝脏损伤、肝癌发生及肝癌类型的影响,并进一步分析不同浓度的TNF-α对HPCs激活、分化的影响在DEN诱导肝癌发生过程中的作用,探讨其中的具体分子机制,以期明确TNF-α影响肝癌发生及肝癌异质性的本质。第一部分:TNF-α在DEN诱导大鼠肝癌发生中的作用研究为了研究TNF-α在肝癌发生中的作用,我们首先建立大鼠DEN诱导肝癌发生模型,并采用高、低不同剂量TNFR2-Fc V进行干预,同时将Tnfα-/-大鼠进行DEN诱癌,分别观察大鼠肝癌发生率、肝功能损伤指标及生存期的变化。实验结果:以高剂量(8 mg/kg)TNFR2-Fc V干预后可以明显降低DEN诱癌大鼠血清中TNF-α浓度,使其与正常水平无显著差异;高剂量TNFR2-Fc V处理及敲除TNF-α均能明显降低DEN诱导大鼠肝癌发生率,但大鼠血清中肝功能指标升高,肝脏损伤加重,生存期缩短。DEN诱癌大鼠在经低剂量(1 mg/kg)TNFR2-Fc V干预后,血清中TNF-α浓度也明显降低,但仍高于正常水平;低剂量TNFR2-Fc V处理后,大鼠肝癌发生率无明显变化,但血清中肝功能指标下调,肝脏损伤减轻,生存期延长。结果提示:TNF-α在DEN诱导大鼠肝癌发生中具有重要作用,阻断TNF-α抑制大鼠肝癌发生率,但缩短生存期,而降低TNF-α浓度虽不影响肝癌发生率,但延长生存期。第二部分:TNF-α对HPCs激活的影响在肝癌发生过程中的作用及机制研究由于高剂量TNFR2-Fc V处理及敲除TNF-α均可以降低DEN诱导大鼠肝癌发生率,为了进一步明确TNF-α影响肝癌发生率及生存期的分子机制,我们选取第一部分实验中高剂量TNFR2-Fc V处理及敲除TNF-α后的大鼠肝脏组织标本,采用免疫组化法及组织免疫荧光法检测阻断TNF-α对DEN诱癌过程中大鼠肝脏损伤及HPCs激活的影响;并使用无标记细胞分析仪(RTCA)、Real-time PCR、Western-blot等方法检测TNF-α对HPCs增殖的影响及分子机制;最后在临床肝癌组织标本中采用免疫组化等方法检测TNF-α影响HPCs激活的相关分子表达,并分析其与TNF-α表达的相关性。实验结果:DEN诱导大鼠肝癌发生过程中,高剂量TNFR2-Fc V处理及敲除TNF-α可以增加肝细胞凋亡、抑制其增殖,与肝癌发生密切相关的HPCs激活数量也明显减少;体内外研究表明TNF-α与HPCs表面TNFR2结合,激活细胞中Stat3信号通路,进一步促进HPCs激活及增殖;临床肝癌癌旁组织标本中TNF-α与HPCs激活的关键分子表达成正相关,进一步验证了我们前期体内外实验结果。结果提示:在肝癌诱发过程中,阻断TNF-α不但可以促进肝细胞凋亡,加重肝损伤,还能抑制HPCs中TNFR2/Stat3信号通路,减少HPCs激活数量,从而减弱肝脏修复能力,降低肝癌发生率。第三部分:TNF-α对HPCs分化的影响在肝癌异质性中的作用及机制研究第一部分结果显示低剂量TNFR2-Fc V处理后DEN诱导大鼠肝癌发生率虽无明显变化,但明显提高了肝癌大鼠生存期。为了研究降低TNF-α浓度对肝癌异质性的影响及作用机制,我们选取低剂量TNFR2-Fc V处理后的大鼠组织标本,采用免疫组化法及组织免疫荧光法检测降低TNF-α浓度对DEN诱发的肝癌类型及关键信号通路的影响;并采用免疫荧光染色、Real-time PCR、Western-blot等方法检测TNF-α对HPCs分化方向的影响及具体机制;最后在临床肝癌组织标本中采用免疫组化等方法检测TNF-α影响HPCs分化方向的相关分子表达,分析其与TNF-α表达的相关性。实验结果显示:DEN诱导大鼠的肝癌病理类型在低剂量TNFR2-Fc V干预后发生明显改变,HCC/CC混合样结构减少,大鼠生存期延长;体外实验中TNF-α诱导HPCs向胆管细胞方向分化,其机制可能与其激活间质细胞中NF-κB信号通路,进而上调胆向分化Notch信号通路配体Jagged 1表达有关;临床原发性肝细胞癌组织标本中,TNF-α表达越高,其复发类型为混合癌的比例越高。结果提示:在肝癌诱发过程中,降低TNF-α浓度不影响肝癌发生率,但可以明显减少HCC/CC混合癌结构,延长生存期,其机制可能与TNF-α通过间质细胞上调HPCs中Notch信号通路被抑制,进而减少HPCs胆向分化有关。