研究背景： 急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是常见的血液系统恶性肿瘤之一。联合化疗是治疗AML的主要方法之一，但治疗效果不尽人意。研究认为，基于AML发病机制和耐药机制而开发的靶向治疗是AML治疗取得突破的希望所在。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是其中的一种靶向药物。 肿瘤的发生与基因组的改变有关。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)参与组蛋白周围DNA卷曲/不卷曲的部分进程，是基因表达的前提条件。HDAC可以使核小体中的组蛋白过度去乙酰化，后者与核小体DNA紧密结合，抑制分化相关基因和抑癌基因等多种基因的转录，进而参与多种肿瘤的发生。因此，抑制HDAC的异常活动所致的基因转录异常成为包括白血病在内的肿瘤治疗的方向之一。 丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是临床治疗癫痫的常用药物，为短链脂肪酸丙戊酸的钠盐，在临床用药剂量范围内能够抑制HDAC活性，属于HDACIs。与其他HDACIs相比，VPA的半衰期长，生物利用性较好及有效血药浓度较低，临床应用毒副作用轻微，可以很好地被病人耐受，成为有临床应用前景的新型抗肿瘤药物。国外临床试验发现VPA可通过上调细胞周期调控因子P21cip1、P27Kip1的表达及下调Bcl—2的表达使细胞周期停滞及细胞凋亡，单独或联合5-氮杂胞苷、全反式维甲酸对难治复发的AML有较好的治疗效果，能逆转细胞的耐药，且副作用小、耐受性好。本课题组的前期实验中，也发现VPA可诱导白血病HL—60细胞凋亡，但具体机制还待进一步探讨。 研究表明，端粒—端粒酶系统对白血病等肿瘤的发生、发展起着重要的作用。端粒是真核细胞染色体末端短的重复的DNA序列组成的特殊结构，对维持染色体的完整性及稳定性有重要作用。大多数正常体细胞没有端粒酶活性，端粒随细胞分裂而进行性缩短，最终导致细胞衰老或凋亡。在肿瘤细胞中，端粒酶处于激活状态，能识别并结合于端粒末端，以自身RNA为模板，通过逆转录合成DNA的方式延伸端粒，使端粒长度保持稳定，抑制细胞凋亡及衰老，导致细胞“永生化”。在组成端粒酶的成分中，催化亚单位——端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是调控端粒酶活性的关键所在，是端粒酶激活的限速因子。多项研究表明hTERT的表达仅限于肿瘤细胞，且其表达与端粒酶的活性平行。在造血系统疾病中急性白血病端粒酶活性最强，初治患者较非恶性血液系统疾病患者端粒酶活性高，治疗缓解后活性降低，复发期端粒酶活性又明显升高。研究发现，曲古抑菌素A(trichostatinA, TSA)、丁酸钠等HDACIs可使hTERT转录受抑，进而导致端粒酶活性下降，引起肿瘤细胞凋亡。但也有人报道HDACIs对端粒酶活性无明显影响，甚至有研究者观察到HDACIs可上调端粒酶活性。VPA作为一个较有临床应用前景的HDACIs，能否影响AML细胞端粒酶活性及其可能的调控途径如何，其抑制AML细胞增殖及诱导凋亡的效应与端粒酶有无关系，目前国内外未见有文献报道。 本课题拟通过检测VPA对人类AML细胞株HL—60细胞增殖、凋亡、hTERT mRNA等的影响，探讨VPA是否可以通过干预端粒酶活性抑制AML细胞增殖和诱导凋亡，为AML的治疗提供新的思路。 实验材料与方法： 1.细胞来源 人急性髓细胞白血病敏感细胞株HL—60细胞购于中国医学科学院天津血液病研究所。 2.实验方法 ①VPA与HL—60细胞共同孵育后，利用光学显微镜观察细胞形态学的变化，CCK—8法检测不同浓度的VPA作用不同时间后细胞的增殖情况。 ②Hoechst33258染色及流式细胞仪检测VPA作用后细胞凋亡情况。 ③流式细胞仪检测VPA作用后细胞周期的变化。 ④Real—time PCR定量检测VPA作用前后细胞中hTERT mRNA的表达。 ⑤Western—blot方法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl—2、Bax、c—Myc的表达； ⑥分光光度法检测药物作用前后细胞中caspase—3酶活性的变化。 3.统计学分析 计量数据的描述用均数±标准差表示(-x±s)；两独立样本均数的比较用t检验，多组资料间均数的比较用单因素方差分析；两个变量间的相关性分析采用Pearson方法。所有数据应用SPSS10.0统计软件处理，检验水准定为P≤0.05有统计学意义。 结果： 1、VPA对HL—60细胞增殖的影响。与阴性对照组相比，VPA对HL—60细胞有不同程度的增殖抑制作用，并且具有剂量和时间效应规律。VPA作用48时，对HL—60细胞的半数抑制浓度(inhibitory concentrationg50，IC50)值为3.23mmol/L。 2、VPA诱导HL—60细胞凋亡。VPA作用后，荧光显微镜下观察HL—60细胞，可见到典型的凋亡小体。经流式细胞仪检测，VPA处理48h后，HL—60细胞的凋亡率在对照组、1 mmol/L组、2mmol/L组、4mmol/L组分别为(7.80±1.29)％、(18.97±0.56)％、(38.64±0.84)％、(63.81±2.17)％，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。 3、VPA对HL—60细胞周期的影响。VPA作用48h后，随着药物浓度的增高，处于G0/G1期细胞比例逐渐增高，S期的细胞比例下降，提示VPA可以将细胞周期阻滞于G0/G1期。 4、VPA降低HL—60细胞hTERT mRNA的表达。VPA作用48h后，HL—60细胞hTERT mRNA的表达在对照组、1mmol/L组、2mmol/L组、4mmol/L组分别为(1.00±0.04)、(0.90±0.03)、(0.73±0.03)、(0.48±0.01)。各组间的差异有统计学意义(P<0.05)，提示随着VPA浓度升高，hTERT mRNA表达逐渐下降。 5、hTERT mRNA表达与细胞凋亡率呈负相关。据统计，VPA作用后，hTERTmRNA的表达与HL—60细胞凋亡率的相关系数r=—0.91(P<0.05)，即细胞凋亡与hTERT mRNA表达存在内在联系，hTERT mRNA表达减少可能引起细胞凋亡增多。 6、VPA对HL—60细胞Bcl—2、Bax、c—Myc蛋白表达的影响。随VPA浓度的增加，Bcl—2、c—Myc蛋白条带亮度逐渐减弱，而Bax蛋白条带亮度逐渐增强，与内参β—actin比较进行半定量分析，结果提示VPA可浓度依赖性地下调Bcl—2、c—Myc蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，各浓度组之间差异有统计学意义(P<0.05)。 7、VPA可增强HL—60细胞caspase—3酶的活力。VPA作用48h后，HL—60细胞的caspase—3酶活力在对照组、1mmol/L组、2mmol/L组、4mmol/L组逐渐增高，各组间的差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 1.VPA可剂量、时间依赖性抑制HL—60细胞增殖，诱导细胞凋亡。 2.VPA对HL—60细胞有周期抑制作用，可将细胞阻滞于G0-G1期。 3.VPA可抑制端粒酶亚单位hTERT mRNA表达水平，hTERT mRNA表达水平与细胞凋亡率呈负相关。 4.VPA可通过下调Bcl—2、c—Myc蛋白的表达，上调Bax表达和增强caspase—3活性，诱导HL—60细胞凋亡。 5.VPA抑制HL—60细胞增殖可能与调节凋亡相关因子Bcl—2、Bax、c—Myc、caspase—3表达、阻滞细胞周期和下调端粒酶活性等机制有关。