【研究背景】肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),是一种急性病毒性传染病,全球90%的HFRS病例发生在我国,该病来势凶猛,变化较快,病死率较高,一直以来严重危害我国人民的身心健康。汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)是引起我国HFRS的主要病原之一,探究HTNV特异性T细胞应答规律以及鉴定HTNV结构蛋白上相关表位对研究其免疫应答机制、免疫治疗方法,以及研发HFRS新型疫苗均具有重要意义。现有的多数研究表明,HTNV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)上具有细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)上存在有中和表位和血凝表位。CTL在识别靶细胞后,可通过穿孔素途径和死亡受体途径杀伤病毒感染细胞,并引起感染细胞的死亡或凋亡,此外还可通过分泌细胞因子调节机体免疫功能。因此,HTNV CTL表位的研究对HTNV感染后的免疫保护和免疫治疗十分关键。近期研究发现HTNV GP也具有诱导T细胞应答的能力,并明确了HTNV GP上存在辅助性T淋巴细胞(Helper T lymphocyte,Th)表位,而目前尚无HTNV GP上是否存在特异性CTL表位的成熟研究报道。若能在HTNV GP上发现并鉴定出CTL特异性表位,对于HTNV新型疫苗的研究具有重要意义。本研究利用生物信息学软件对HTNV GP一级结构进行了相关参数分析,最终预测并合成了15个H-2K~b限制性CTL表位肽,并对其进行了筛选、鉴定及生物学活性和免疫学特性研究,以期明确HTNV GP上是否存在CTL特异性表位。【研究方法】用生物信息学表位预测软件IEDB(Immune epitope database and analysis resource)将HTNV GP一级结构进行相关参数分析,对可能存在的CTL表位进行预测;同时用另一生物信息学软件BIMAS(Bio Informatics and molecular analysis section),综合评价各预测表位与小鼠主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)编码产物H-2K~b分子的结合指数,最后初步筛选出15个H-2K~b限制性HTNV CTL表位肽并合成。通过酶联免疫斑点实验(Enzyme Linked Immunospot assay,ELISPOT),将HTNV感染C57BL/6小鼠脾细胞,分别用上述预测的15个HTNV CTL表位肽刺激,并用已知HTNV NP特异性CTL表位肽NP1作为阳性对照,筛选出可有效刺激感染小鼠脾脏中T细胞分泌IFN-γ的多肽;进而,以CD4+T细胞去除后的小鼠脾细胞(CD4depleted SP)或CD8+T细胞去除后的小鼠脾细胞(CD8 depleted SP)作为效应细胞,利用ELISPOT实验筛选并鉴定出能刺激CD8+T细胞反应的CTL优势表位肽。通过CTL杀伤实验,以HTNV感染小鼠脾细胞作为效应细胞,分别用抗原肽致敏的EL-4细胞和HTNV感染的巨噬细胞作为CTL杀伤实验的靶细胞,进一步验证各HTNV GP CTL表位肽是否具有刺激效应细胞应答的潜能。在上述工作的基础上,我们进一步研究并分析了HTNV GP CTL表位肽的生物学活性及免疫学特性。通过淋巴细胞增殖实验检测CTL表位肽促进C57BL/6小鼠外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖的能力;采用胞内细胞因子染色法检测CTL表位肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力。进而,将CTL表位肽与弗氏佐剂充分乳化后,皮下多点注射免疫C57BL/6小鼠,以已知HTNV NP特异性CTL表位肽NP1、HFRS灭活疫苗作为阳性对照;以PBS、弗氏佐剂作为阴性对照。总共免疫4次,每次间隔10天,在末次免疫后第10天,通过ELISPOT和CTL杀伤实验,分别检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力以及CTL的特异性杀伤活性,进而评价抗原表位肽在体内所介导的细胞免疫应答水平;通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)和微量细胞中和实验,分别检测免疫小鼠血清中抗HTNV NP及GP的特异性抗体滴度和中和抗体滴度,进而评价抗原表位肽在体内所介导的体液免疫应答水平。同时取HTNV 76-118株以105 pfu/只的感染剂量,采用肌肉注射的途径感染免疫小鼠,病毒感染后第3天,通过ELISA和实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR),分别检测免疫小鼠各组织脏器中HTNV特异性抗原和核酸。从而综合评价CTL表位肽对HTNV感染小鼠的保护作用。【实验结果】根据IEDB预测表位肽的Percentile Rank排名(Percentile Rank值越低,意味着预测的CTL表位肽可能诱导机体产生的免疫应答能力越强),筛选出HTNV GP上排名前15个H-2K~b限制性CTL表位肽,均由8个氨基酸组成,分别为GP1(aa39-aa46:SVIGYVEL)、GP2(aa44-aa51:VELPPVPL)、GP3(aa64-aa71:SMDNHQSL)、GP4(aa208-aa215:IVCFFVAV)、GP5(aa420-aa427:VNFVCQRV)、GP6(aa456-aa463:ITSLFSLL)、GP7(aa489-aa496:VTFCFGWV)、GP8(aa499-aa506:PAITFIIL)、GP9(aa797-aa804:ITIRYSRR)、GP10(aa845-aa852:TLLFFGPL)、GP11(aa925-aa932:QSFNTSTM)、GP12(aa987-aa994:VGFTLTCL)、GP13(aa1102-aa1109:FSGNWIVL)、GP14(aa1113-aa1120:CVFLLFSL)、GP15(aa1114-aa1121:VFLLFSLV);BIMAS综合评价了各预测表位肽与H-2K~b分子的结合指数,表明预测的15个CTL表位肽均可与H-2K~b分子结合,结合指数越高意味着其与H-2K~b分子之间的亲和力越大。ELISPOT结果显示,在预测的15个CTL表位肽中,只有GP1、GP2、GP3、GP6、GP8、GP10等6个可诱导HTNV感染小鼠脾脏中T淋巴细胞分泌IFN-γ,其平均斑点形成细胞数(Spot-forming cells,SFC)分别为225,130,257,461,196,162。用上述6个阳性抗原肽分别刺激去除CD4+T细胞的淋巴细胞时,GP1、GP2、GP3、GP8、GP10均未明显诱导淋巴细胞分泌IFN-γ,而GP6保持较高的斑点数,其平均SFC为421;同时,用上述6个阳性抗原肽分别刺激去除CD8+T细胞的淋巴细胞时,结果恰好相反,GP1、GP2、GP3、GP8、GP10刺激淋巴细胞后保持较高的斑点数,其平均SFC分别为216、129、229、183、179,而GP6未明显诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。而且GP6的实验结果与阳性对照NP1的实验结果一致。上述结果表明,GP6可能为HTNV GP特异性CTL优势表位肽。CTL杀伤实验结果显示,当HTNV感染的小鼠脾细胞分别用GP6、阳性对照NP1刺激后作为效应细胞,抗原肽致敏的EL-4细胞(H-2K~b限制性)、HTNV感染的小鼠腹腔巨噬细胞作为靶细胞时,随着效靶比(Effector cell/Target cell,E/T)的升高,其特异性杀伤活性也随之提高;然而,当抗原肽未致敏的EL-4细胞、HTNV未感染的巨噬细胞,以及P815细胞(H-2Dd限制性)作为靶细胞时,效应细胞的非特异性杀伤活性均较低,未超过10%。结果表明,GP6能够有效刺激CTL对HTNV感染的靶细胞进行特异性杀伤。对HTNV GP6进行生物学活性鉴定,其流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测结果显示,GP6可有效刺激小鼠PBMC的增殖,与阴性对照组相比,增殖的细胞占细胞总数的比例明显增加,二者存在显著的统计学差异;并且GP6可强烈诱导小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ,与阴性对照组相比,其IFN-γ+CD8+T细胞占CD8+T细胞总数比例明显增加,二者存在显著的统计学差异。对HTNV GP6进行免疫学活性检测的结果表明,GP6可刺激C57BL/6小鼠产生强烈的细胞免疫应答,且免疫小鼠脾细胞IFN-γ应答水平均显著高于其他各组。CTL杀伤实验结果表明,随着E/T的升高,GP6特异性CTL的杀伤活性不断增强。但GP6未能诱导C57BL/6小鼠产生针对HTNV GP的特异性抗体以及中和抗体。对免疫小鼠进行动物保护实验的ELISA结果显示,在GP6和阳性对照NP1免疫组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏中,其HTNV特异性抗原含量与PBS、弗氏佐剂对照组相比,明显降低。qRT-PCR结果显示,在GP6和阳性对照NP1免疫组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏中,其HTNV核酸载量与PBS、弗氏佐剂对照组相比,明显降低,该结果与ELISA检测结果相一致。在GP6免疫组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏中,其HTNV特异性抗原含量以及核酸载量,与阳性对照NP1免疫组相比,无统计学差异。上述结果表明,GP6在体内所介导的细胞免疫应答对HTNV感染小鼠具有一定的保护作用。【结论】本研究成功筛选并鉴定出HTNV GP上一个CTL优势表位肽—GP6,可强烈诱导CD8+T细胞应答,并具有良好的生物学活性。将其与弗氏佐剂混合免疫C57BL/6小鼠后,可有效诱导机体产生特异性细胞免疫应答,而且相关细胞免疫检测指标均优于HFRS灭活疫苗组。免疫小鼠保护实验结果证实,GP6抗原表位肽所介导的细胞免疫应答对HTNV感染小鼠具有一定的保护作用。本研究为探究HTNV GP上特异性CTL表位提供了依据。