登革热(dengue fever,DF)是由登革病毒引起的虫媒病毒性传染病，主要通a过埃及伊蚊(αedes αegypti)和白纹伊蚊(αedes αlbopictus)传播，登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)则是登革热的一种严重类型，伴有休克症状的登革出血热称为登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)。本病广泛流行于热带和亚热带地区，是世界上分布最广、发病人数最多、危害最大的一种虫媒病毒性疾病，已经成为一个世界性的严重公共卫生问题。　　 我国登革热的首次流行发生于1873年福建省厦门市，建国后的首次暴发流行发生于1978年广东省佛山市，自1978年以来我国已发生14次登革热暴发流行或局部流行，以广东、海南、福建等东南沿海地区为主，登革热也已经成为我国的一个严重公共卫生问题。　　 登革病毒(dengue virus，DENV)属于黄病毒科，分为Ⅰ～Ⅳ型四个血清型。DENV是正链RNA病毒，大小约为11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。目前，登革热的发病机制尚未阐明，也没有有效的疫苗或治疗药物。新近的研究表明，RNA干扰技术可能成为治疗登革病毒感染的新的突破口。　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种由双链RNA(double-strandRNA，dsRNA)启动的序列特异性基因沉默机制，由Andrew Z.Fire于1998年首先发现并命名。RNAi从线虫到人类细胞中都广泛存在，是自然界中生物抵抗外源基因或病毒入侵的一种防御方式。　　 近年来，RNAi方面的研究取得了很大进展，2000-2002年连续3年被《Science》杂志列入年度世界十大科学突破。RNAi技术已被广泛应用于病毒防治、基因功能研究、肿瘤基因治疗、信号转导等多种领域，充分显示了其巨大的应用潜力。作为宿主细胞抑制病毒复制、清除病毒的一种胞内机制，RNAi已被证明可应用于HIV、HBV以及SARS冠状病毒等多种抗病毒感染研究领域。　　 慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，作为一种新型的基因治疗载体，已广泛应用于多种基因功能的研究中。慢病毒能感染分裂细胞和非分裂细胞，且慢病毒在感染细胞后能整合到受感染细胞的基因组中，随着细胞的生长而长时间稳定表达目的基因，因此不需要反复感染，效果持久。慢病毒介导的RNAi具有高效、持久、稳定的特点，是携带干扰RNA的理想载体。　　 目前，由慢病毒介导的RNAi抑制登革病毒复制的研究尚未见文献报道，因此，本研究拟针对Ⅰ型登革病毒设计特定序列的siRNA(small interfering RNA)，在白蚊伊蚊C6/36细胞中筛选可高效抑制登革病毒复制的siRNA序列；再将该序列重组到慢病毒载体中，构建长效表达siRNA慢病毒载体，包装慢病毒，并将其导入C6/36细胞中，为下一步研究RNAi长效抑制登革病毒的复制奠定基础，为登革热的疫苗研制和临床基因治疗提供依据。主要研究内容及结果：　　 第一部分高效抑制登革病毒在蚊细胞中复制的siRNA序列筛选　　 1.Ⅰ型登革病毒的扩增与定量病毒毒株采用广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ02-218，感染C3/36细胞进行病毒扩增，细胞病变达到++时收获病毒，TCID50测定病毒滴度，结果测得病毒TCID50为10-3.5/0.1ml。　　 2.siRNA序列的设计与合成根据GenBank中广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ02-218、Ⅰ型登革病毒参考株及其它Ⅰ型登革病毒基因序列，针对病毒基因组不同位置设计了10段siRNA序列，经生物信息学分析，选择合成其中4段siRNA(DenSi-1～4)。　　 3.有效siRNA序列的初步筛选采用脂质体法将合成的4段siRNA序列转染到C6/36细胞中，转染6小时后用登革病毒攻击。病毒攻击5～7天后，根据各组细胞病变情况，初步确定siRNA片段DenSi-2～4无效，片段DenSi-1有效，可进一步探讨其干扰作用。　　 4.siRNA对登革病毒干扰作用的探讨：　　 (1)siRNA稳定性用标记FAM荧光基团的siRNA转染C6/36细胞，流式细胞仪测得转染后6h及第1、3、5、7天含有荧光的细胞占总细胞数的百分比分别为66.0％、52.1％、32.0％、13.5％、8.9％。　　 (2)实验分组C6/36细胞分为以下四个组：正常组：无siRNA转染、病毒感染；siRNA组：转染siRNA后用病毒感染攻击；转染对照组：转染21nt的对照siRNA序列后用病毒感染攻击；病毒阳性对照组：不转染siRNA，直接用病毒感染攻击。　　 (3)siRNA对受登革病毒攻击的C6/36细胞形态的影响登革病毒攻击7天后，观察各组细胞形态，可见：正常组细胞无病变；病毒阳性对照组和转染对照组出现大量细胞病变，细胞肿胀并成片融合达到++++，细胞数目明显减少；siRNA组细胞无病变，细胞数目无明显减少。　　 (4)MTT法检测C6/36细胞存活率结果登革病毒攻击7天后，MTT法测得各组细胞存活率为：siRNA组76.9％±4.5％，转染对照组43.9％±3.6％，病毒阳性对照组23.6％±14.6％。siRNA组与病毒阳性对照组相比具有显著性差异，细胞存活率增加2.26倍(P＜0.05)；转染对照组与病毒阳性对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。　　 (5)siRNA对C6/36细胞内登革病毒RNA含量的影响登革病毒攻击7天后，用荧光定量PCR法检测细胞内登革病毒核酸量，正常组未检测到病毒核酸，siRNA组CT值为19.9140.63，转染对照组CT值为14.63±0.91，病毒阳性对照组CT值为14.56±0.39。siRNA组与病毒阳性对照组相比△CT值为5.34，其病毒核酸量仅为病毒阳性对照组的1/25.34，约1/40，siRNA对C6/36细胞内登革病毒复制的抑制率达到97.54％，具有显著性差异(P＜0.05)；转染对照组与病毒阳性对照组相比△CT值为0.07，无显著性差异(P＞0.05)。　　 第二部分siRNA慢病毒载体的构建、包装及鉴定　　 1.慢病毒载体的构建及鉴定　　 (1)根据第一部分筛选得到的有效siRNA片段设计合成一对DNAoligo序列，经退火形成双链后，在T4链接酶作用下，与线性化的表达质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR进行链接反应，产物转化感受态细胞DH5α，经抗性基因(Blasticidin)筛选得到的阳性克隆，通过测序验证完全正确，表明重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-SR42构建成功，大量扩增质粒备用。　　 (2)采用Gateway重组技术构建重组慢病毒载体：将重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-SR42与质粒pDONRTM221和pLenti6/V5-DEST进行快速BP/LR重组反应，得到重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-SR42，产物转化感受态细胞OneShotStb13，经抗性基因(Amplicillin)筛选得到的阳性克隆，通过测序验证完全正确，表明重组慢病毒载体构建成功，大量扩增质粒备用。　　 2.慢病毒包装与滴度测定用LipofectamineTM2000将重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-SR42，与包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293FT细胞，转染48h后收集病毒上清液，经纯化后感染293FT细胞进行病毒滴度测定，测得的病毒滴度为：7.5*107TU/ml。　　 3.慢病毒感染293T细胞，检测miRNA的表达。　　 慢病毒以MOI=5感染293FT细胞，72小时后收集细胞，Trizol法提取总RNA，RT-PCR扩增目的序列，扩增产物测序验证miRNA的表达。测序结果经序列对比完全正确，表明重组慢病毒能够在靶细胞中表达目的基因。　　 4.慢病毒感染C6/36细胞慢病毒以MOI=10感染C6/36细胞，72小时后在荧光显微镜下观察GFP表达情况。可见慢病毒组细胞内有较多绿色荧光，而空白对照组无荧光表达，表明慢病毒成功转染至C6/36细胞中。　　 结论及研究意义：　　 1.获得了一段长为21nt的siRNA序列，证实了其能够有效抑制登革病毒在蚊细胞中的复制。siRNA转染C6/36细胞后，能增加细胞存活率，并减少病毒载量。　　 2.成功构建了表达siRNA的慢病毒载体，并将其成功转染至C6/36细胞中，验证了其在靶细胞C6/36细胞中的表达。　　 3.为下一步研究RNAi长效抑制登革病毒的复制奠定了基础，为登革热的疫苗研制和临床基因治疗提供了依据。