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研究背景钙化性主动脉瓣疾病（Calcific aortic valve disease,CAVD）是心血管外科常见的心脏瓣膜疾病,以瓣膜纤维化及钙化为其病理特点。目前缺乏内科保守治疗方案,病变晚期伴随明显临床症状及血流的动力学改变时只能行主动脉瓣置换术治疗。费用昂贵、围术期风险高是患者经常面临的两大困难。因而研究CAVD的发病机制和药物治疗靶点一直是CAVD的研究热点。目前研究证实CAVD是由多种因素共同参与的病理过程,并能分为2个阶段:启动阶段和进展阶段。瓣叶在启动阶段可逐渐进展为主动脉瓣硬化,其病理过程与动脉粥样硬化相似,包括主动脉瓣内皮损伤、脂质沉积以及炎性反应。进展阶段主要为主动脉瓣间质的纤维化和钙化,瓣膜间质细胞（Valve interstitial cells,VICs）向成骨细胞转分化可能是瓣膜异位成骨的理论基础。目前已在CAVD瓣膜样本中观察到Runx2、Sp7、转录激活因子4（Activating Transcription Factor 4,ATF4）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、骨钙蛋白（Osteocalcin,OCN）等多种成骨相关蛋白的阳性表达。micro RNA是一类长约18-26bp的非编码RNA,主要通过转录后调控机制沉默目的信使RNA（Messenger ribonucleic acid,m RNA）或促进m RNA的降解。近年来,mi R-214被报道与骨组织正常发育及骨疾病有关,其在脊椎动物中表达相当保守,并通过调节成骨细胞和破骨细胞的活性以维持骨组织的稳态。此外,mi R-214可作为治疗骨病的靶向药物并在动物实验中得到证明。micro RNA在CAVD中的调控作用目前尚且初步探索阶段。鉴于CAVD为主动脉瓣异位成骨的病理过程,mi R-214表达失调可能与CAVD发生发展有关。近年研究发现,mi R-214在钙化主动脉瓣中表达明显下调,与此同时也观察到成骨相关蛋白表达明显上调。然而mi R-214在CAVD中的作用及机制研究鲜有报道。因此探索mi R-214在CAVD中的作用及机制有助于深入理解CAVD的发病机制,有可能为mi R-214作为靶向药物治疗CAVD提供理论基础。目的1、明确mi R-214及成骨相关蛋白在CAVD进程中的差异表达;2、明确mi R-214在瓣膜间质细胞成骨分化过程中的作用及机制;3、明确mi R-214在CAVD动物模型中的作用。方法A、人瓣膜样本组织学及分子生物学检测1、临床标本收集:通过收集临床上因CAVD行主动脉瓣置换术患者主动脉瓣标本,并以同时期行心脏移植受体主动脉瓣作为阴性对照,立即储存于福尔马林溶液及液氮中用于组织学及分子生物学检测。2、组织成骨相关蛋白差异表达:茜素红染色以及HE染色再次确定瓣膜病理改变类型,通过免疫印迹、免疫组化分析成骨相关蛋白在两组样本中的表达差异。3、组织mi R-214差异表达:通过实时定量PCR检测两组样本中mi R-214的表达差异。B、瓣膜间质细胞分离、鉴定以及体外成骨诱导模型建立1、VICs分离:利用II型胶原酶二次消化法分离人主动脉瓣中VICs,避免内皮细胞污染,稳定传代后第2-5代细胞用于细胞学实验。2、VICs鉴定:利用细胞免疫荧光检测VICs的间质细胞标志物Vimentin及α-SMA以及内皮细胞标志物CD31的表达明确获取细胞的纯度。3、VICs体外成骨诱导分化模型建立并鉴定:利用2mmol/L Na H2PO4为基础的成骨诱导培养基处理并刺激VICs,并用实时定量PCR以及免疫印迹法检测不同时间点VICs中成骨相关蛋白的表达变化,并通过茜素红染色明确体外模型是否构建成功。4、体外成骨诱导分化模型中mi R-214差异表达:通过实时定量PCR检测体外模型不同时间点VICs中mi R-214的表达水平变化。C、mi R-214调控VICs成骨分化的作用及机制研究1、mi R-214的作用研究:通过细胞转染技术分别转染agomir-214和antagomir-214,并通过实时定量PCR检测VICs中mi R-214的表达水平,进而通过实时定量PCR、免疫印迹以及茜素红染色检测不同mi R-214表达水平对VICs成骨分化的影响。2、mi R-214的机制研究:利用生物信息学分析预测mi R-214的潜在结合位点,通过构建荧光素酶报告基因载体验证mi R-214与预测位点的靶向结合作用,最后通过拯救实验再次验证结合位点的特异性。D、mi R-214调控CAVD的体内实验研究1、mi R-214基因敲除大鼠代数扩增及基因型鉴定:利用基因敲除技术构建mi R-214基因敲除大鼠并扩增3代,通过琼脂糖电泳以及实时定量PCR鉴别大鼠基因型。2、CAVD大鼠模型建立:利用西式饮食辅助腹腔注射维生素D的方式构建大鼠CAVD模型,利用HE染色以及茜素红染色明确建模效果。3、mi R-214体内功能验证:将大鼠分为野生型、杂合子、突变型三组并同时构建CAVD模型,利用心脏超声比较三组大鼠跨主动脉瓣压差及流速的变化评估主动脉瓣狭窄程度,利用茜素红染色比较三组大鼠主动脉瓣钙化程度,利用免疫组化比较三组大鼠主动脉瓣成骨相关蛋白表达水平变化,明确mi R-214于动物模型中对CAVD进程的作用。研究结果A、人体瓣膜组织组织学及分子生物学检测通过Western Blotting、免疫组化分析发现CAVD瓣膜组织中,成骨早期相关蛋白Runx2和Sp7以及成骨晚期蛋白OPN和ATF4的表达明显上调。实时定量PCR结果显示mi R-214在钙化组织中表达显著下调。B、瓣膜间质细胞分离、鉴定以及体外成骨诱导模型建立成功利用II型胶原酶消化获取人VICs,细胞形态成梭形,传代至第2代后形态稳定。细胞免疫荧光结果提示VICs中间质细胞标志物Vimentin及α-SMA阳性表达,无内皮细胞标志物CD31表达,提示获取的VICs纯度可。成骨诱导培养基处理并刺激VICs后,PCR以及Western Blotting均检测到成骨相关蛋白从第3天开始表达显著上调,茜素红染色提示第7天可见明显钙结节形成提示建模成功。实时定量PCR结果证明VICs成骨诱导后1天即可出现mi R-214的表达显著下调并持续维持在较低水平。C、mi R-214调控VICs成骨分化的作用及机制研究通过PCR、Western Blotting以及茜素红染色等结果证明上调VICs中mi R-214的表达水平后可显著抑制VICs成骨分化,下调VICs中的mi R-214表达后则促进VICs成骨分化。生物信息学分析预测ATF4及Sp7的3’-UTR均存在mi R-214的潜在结合位点。荧光素酶报告基因结果验证了mi R-214与ATF4及Sp7的靶向结合作用。利用si RNA下调ATF4以及Sp7的表达后可以部分逆转mi R-214低表达的促VICs成骨分化作用,拯救实验再次验证结合位点的特异性。D、mi R-214参与CAVD的体内实验研究通过琼脂糖电泳和实时定量PCR结果可鉴定新生大鼠基因型。HE染色以及茜素红染色结果提示西式饮食辅助腹腔注射维生素D的方式可成功构建大鼠CAVD模型。大鼠CAVD建模4月后,心脏超声结果提示mi R-214基因敲除大鼠主动脉瓣瓣叶明显增厚,主动脉瓣跨瓣压差及流速增大。茜素红染色发现基因敲除大鼠主动脉瓣钙化明显。免疫组化结果提示mi R-214基因敲除后成骨相关蛋白Runx2、OPN、Sp7、ATF4的表达明显上调,提示mi R-214敲除后可促进主动脉瓣钙化。研究结论CAVD发展过程中伴随瓣叶组织中mi R-214表达水平下降,同时VICs体外成骨分化模型中也观察到此现象。Mi R-214低表达解除了其对成骨转录因子Sp7和ATF4的抑制作用,进而促进CAVD的发展。本研究结果提示mi R-214可能作为治疗CAVD的潜在靶点。