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皮肤是阻止有害化学物进入机体的天然屏障,同时也是易于受到伤害的器官,环境污染物、职业暴露、化妆品使用等都可能造成皮肤伤害引起局部甚至全身毒性。化妆品的使用与人类生活息息相关,其目的是保护健康和美化生活,因而有效的评价化妆品的安全性,对保障消费者健康、促进化妆品产业的发展都具有重要意义。传统的化妆品安全性评价方法采用豚鼠或兔作为受试动物,不仅需要大量的动物、耗时长、成本高,不能满足化合物快速增长的需要,而且存在敏感性不够,种属差异等缺点,特别是不符合动物保护和福利的要求。因此,按照“4R”原则,发展快速、高效、敏感的毒理学安全性评价替代方法成为主要的发展趋势和近几年国际上的研究热点之一。欧盟更提出从2009年3月起将禁止利用动物进行化妆品的测试,也不允许其成员国进口经动物实验检验的产品。我国是化妆品生产和使用大国,建立能与国际接轨的化妆品替代实验方法具有非常的迫切性。本文拟在借鉴欧盟研究成果的基础上,对化妆品安全性评价中若干皮肤毒性的替代实验方法进行研究。目的是为国内开展相关方法学研究和制定我国化妆品安全性评价替代实验方法的技术指南提供依据。一、小鼠局部淋巴结试验（LLNA）方法的改进研究目的改进小鼠局部淋巴结试验（LLNA）,建立既可检测化学物的致敏性也可同时检测刺激性的LLNA替代方法。方法选取一种阴性物质:4-氨苯甲酸;三种致敏阳性物:2,4-二硝基氯苯（DNCB）、己基肉桂醛（HCA）和2-氨基酚（2-APC）;以及两种刺激阳性物:氢氧化钾（KOH）、十二烷基硫酸钠（SDS）。按常规LLNA方法对雌性Balb/c小鼠进行染毒,测量小鼠耳缘厚度,于第6天仁慈处死小鼠称量耳廓重量,获取耳引流淋巴结进行称重,制备单细胞悬液计数并用cck-8试剂盒检测淋巴细胞增殖活性。结果受试剂量氢氧化钾、十二烷基硫酸钠和2,4-二硝基氯苯在0.5%以上剂量,可引起耳缘厚度和耳廓重量增加,与对照组相比差异有显著性（p<0.05）,可能判定为对皮肤有刺激性;2-氨基酚和己基肉桂醛均无刺激性。三种致敏物在致敏试验中均呈阳性,但不同检测指标敏感性有差异。己基肉桂醛,2,4-二硝基氯苯,2-氨基酚均可引起淋巴结重量增加,差异有显著性（p<0.05）;三者均可引起淋巴细胞计数增加,但己基肉桂醛仅在最高剂量组有统计学差异;己基肉桂醛和2,4-二硝基氯苯在中剂量以上组和高剂量十二烷基硫酸钠均可致cck-8检测的淋巴细胞增殖明显增加,氢氧化钾在致敏性指标中均为阴性。结论以耳缘厚度和耳廓重量作为刺激性观察指标,以淋巴结重量和淋巴细胞增殖作为致敏性观察指标的改良小鼠淋巴结试验可有效地同时评价化学物的皮肤致敏性和刺激性,有发展成为一种替代方法的潜力。二、皮肤刺激性EpidermTM模型实验方法的建立目的通过构建重组人EpiDerm皮肤模型,建立检测化妆品的皮肤腐蚀性/刺激性的替代实验方法。方法取人的包皮组织,分离表皮和真皮后分别进行原代培养,用鼠尾胶原构建皮肤模型,经气液面培养后,腐蚀性试验作用3min和1h,刺激性试验作用15min后续培养42h,检测化学物致皮肤模型细胞活性的改变（MTT试验）和IL-1α的释放量（ELISA法）,评价化学物的腐蚀性/刺激性。结果腐蚀性试验中,MTT检测作用于3种腐蚀性化学物（正辛酸、10%KOH、丙烯酸）后,细胞相对活性均<50%（3min）和<15%（1h）;而2种非腐蚀性化学物（四氯乙烯、丁香酚）使细胞相对活性变化不大。刺激性试验中,MTT检测4种刺激性化学物细胞相对活性,其中3种化学物（三氯乙烷、5%KOH、10%SDS）致细胞活性明显小于50%, 2种非刺激性化学物（乙醇、丙二醇）和1%TritonX-100作用后细胞活性>50%,在ELISA试验中,仅TritonX-100致IL-1α释放量大于60pg/ml,说明其同样具有刺激性。结论所建人重组皮肤模型实验方法基本成功,可以做为检测化学物皮肤腐蚀性/刺激性的体外替代方法。三、THP-1细胞体外致敏性试验方法的研究目的探讨建立以THP-1为受试细胞,以细胞表面标志物CD54和CD86的抗体表达改变为检测指标的体外致敏性试验方法。方法采用人单核细胞系白血病淋巴瘤细胞THP-1,经过细胞因子GM-CSF、IL-4诱导分化成未成熟树突状细胞后,分别对未诱导THP-1细胞和诱导后细胞给予受试物,用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD54和CD86的抗体表达改变,评价化学物对皮肤的致敏性。结果致敏物DNCB、HCA、EN作用于THP-1细胞后,DNCB和EN能使CD54和CD86的抗体荧光表达增强,与对照相比大于140%,但HCA致荧光增强不明显。受试物作用经诱导后的未成熟树突状细胞,表面抗体的荧光表达量都未见明显增高。结论采用THP-1细胞检测CD54和CD86的抗体表达的试验方法,可检测中高致敏性化学物,但不适合弱致敏性化学物的评价。四、利用人皮肤组织模型研究纳米TiO2的经皮吸收和致突变性目的探讨纳米TiO2能否穿透皮肤组织并产生基因突变作用。方法构建人重组皮肤模型后培养于Tanswell小室上方,下层培养L5178Y细胞,将纳米TiO2作用于皮肤模型上,采用微孔板Tk基因突变的试验方法检测下层L5178Y细胞是否发生基因突变。结果随着受试纳米TiO2浓度的增加,直接接触和间接接触细胞的相对悬浮生长率均呈下降趋势,但间接接触的细胞相对悬浮生长率普遍大于直接接触者。随着剂量的增加,平板效率和相对存活率也呈现下降趋势,但各组间TFT突变率却无明显差别。结论纳米TiO2能穿透人皮肤组织模型,但皮肤模型有一定的屏障作用,对皮肤组织模型下层L5178Y细胞无致基因突变作用。