目的:　　脓毒症(sepsis)是由感染引起的失调的宿主反应，可造成危及生命的器官功能障碍，也是诱发脓毒症性休克、多器官功能障碍综合征的重要原因。心脏作为脓毒症所致的多器官功能障碍的主要靶器官之一，常有不同程度功能障碍，而心功能障碍使得脓毒症进一步恶化，称为脓毒性心肌病。脓毒症严重程度及病死率与心功能障碍程度密切相关，心肌损害出现的越早，患者的病情越重，一旦出现心血管并发症，患者病情就会急剧恶化，心功能障碍是严重脓毒症以及感染性休克患者的主要死因。脓毒症时心肌功能障碍的可能机制，主要包括:　　(1)破坏线粒体的氧化磷酸化，心肌细胞缺氧、氧化磷酸化脱偶联、细胞产生高能磷酸盐的能力降低;　　(2)细菌内毒素的直接心肌毒性;　　(3)“心肌冬眠”（脓毒症的关键是不能利用ATP，而心肌冬眠是一种适应性反应，减少心输出量和降低耗氧，来维持ATP水平的稳定，对心力衰竭做出适应性反应）;　　(4)一氧化氮(N0)、一氧化氮合酶(NOS)持续表达降低心肌收缩力引起心血管功能障碍;　　(5)钙离子通道变化可导致钙离子漏等现象引起心力衰竭。　　兰尼碱受体(Ryanodine Receport，RyR)是一种大分子复合物，由肌浆网中调节Ca2+释放的约5000个Ca2+通道残基组合而成，因为它和被称为兰尼碱的一种植物碱具有很高特异性，由此得名。兰尼碱受体对于肌肉和心脏的节律和收缩是必不可少的一部分，它参与调节肌浆网(Sarcoplasmic Reticulum，SR)释放Ca2+，肌浆网常受四个因素调节作用:　　(1)L型钙离子通道;　　(2)SR兰尼碱受体;　　(3)肌浆网钙泵;　　(4)细胞膜钠离子钙离子交换。　　兰尼碱受体2主要分布在心脏是心脏中调节Ca2+释放的主要通道之一，由同源四聚体形成，有一个大的细胞质组件和跨膜域组成孔隙区域。Ca2+被认为是心脏收缩过程中最重要的因素，心脏收缩是通过由RyR2介导的SR中的Ca2+释放引起。在正常心肌收缩情况下，RyR2被细胞溶质中的Ca2+激活，每次心脏搏动Ca2+从细胞外通过L型钙通道进入胞质，然后激发RyR2释放Ca2+。心力衰竭时，交感神经活动增加，通过使交感肾上腺素能神经系统兴奋，肾上腺素信号通路激活，继而儿茶酚胺水平显著增加，高浓度儿茶酚胺慢性刺激使cAMP依赖的蛋白激酶A(Proteine Kinase A，PKA)或/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin Dependent Protein KinaseⅡ，CaMKⅡ)对RyR2高度磷酸化，激活RyR2通道，产生肌浆网Ca2+漏，有大量证据表明，大分通道重塑和翻译后修饰的改变，是肌浆网Ca2+漏增加的基础。持久性的肌浆网Ca2+漏会导致肌浆网Ca2+负荷下降，致使肌浆网Ca2+储存减少以及心脏收缩偶联降低，从而抑制肌浆网Ca2+释放和收缩过程。严重的肌浆网Ca2+漏将导致心力衰竭，病死率上升。　　近年来关于兰尼碱受体的作用以及在心肌损伤中的变化一直受到很多关注。兰尼碱受体变化是导致心功能下降的重要因素。目前大量的研究都是基于RyR2复合体对于多种蛋白的相互影响，对于心脏收缩力的影响，以及可能潜在引起的心脏疾病。已经有研究表明，慢性心衰时，兰尼碱受体随时间的延长是处于下降的趋势，而其中兰尼碱受体的磷酸化水平处于持续上升水平。脓毒症时兰尼碱受体表达变化以及与脓毒症心功能障碍关系鲜有报道。我们推测脓毒症休克时会有兰尼碱受体表达降低，参与了脓毒症心功能障碍的发生发展过程。本实验在脓毒性休克的特定条件下，随病程的进展动态监测了RyR2总量变化以及其磷酸化水平在心功能下降的过程中的表达的变化情况。我们的课题组前期已经经过大量研究证明，脓毒性休克后发生的心肌损害会导致心功能下降，诱发或加重休克。为了进一步明确这种心肌损害的机制，本研究采用脓毒性休克大鼠模型，观察不同程度心功能障碍时，心肌收缩舒张功能的变化情况、心肌组织的病理变化、心肌兰尼碱受体2的基因及蛋白表达水平，探讨脓毒性休克时心肌兰尼碱受体与心功能变化的关系。　　研究方法:　　1、实验动物分组与脓毒性休克模型建立　　将大鼠用随机数字法分为脓毒性休克组与对照组，脓毒性休克组与对照组又依不同时间分为4组0小时、2小时、4小时、6小时，每组6只，脓毒性休克组在大鼠休克后开始计时，对照组给予乌拉坦麻醉后待血压稳定后开始计时。予大鼠20％的乌拉垣溶液5ml/kg腹腔注射麻醉。实验组采用股静脉注射LPS20mg/kg，约5分钟缓慢注射，复制脓毒性休克模型。对照组注射同等量生理盐水。大鼠麻醉后仰卧，四肢拉直固定，剪去颈部、大腿及腹股沟的毛，靠近大腿左侧腹股沟处，剪开皮肤，逐层钝性分离组织和肌肉，注意股静脉、股动脉、股神经共同行走于动脉鞘内，打开包膜后可见鲜红股动脉，予股动脉置管，通过三通头连接生理记录仪(泰盟BL-420F)，采集生理信号，通过系统监测大鼠血压，监测大鼠平均动脉压(MAP)，以MAP值比基础值下降25％-30％为休克标准。予大鼠颈动脉、股动脉、股静脉插管，颈动脉、股动脉导管另一端通过三通头与生理记录仪（泰能BL-420L）连接，通过生理信号采集处理系统，以软件记录左室舒张末压(LVEDP)、收缩期左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)，LVEDP上升、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降说明大鼠心肌顺应性降低、心肌收缩力下降。检测大鼠股动脉血压变化，记录休克时间点。　　2、标本的采集及制备　　在大鼠达到实验对应时间点后，先迅速打开腹腔，分离腹主动脉，采集3ml腹主动脉血，在玻璃管中离心分离血清，移入-20℃保存。迅速打开胸腔，严格无菌取心脏，置于4℃生理盐水中，以便于排尽心脏内残余血液，分离右心室、右心房以及左心房，留取左室心肌，将左室心肌切取两部分，一部分用40 g/L多聚甲醛固定留作HE染色、免疫组化备用;一部分置于低温冻存管中液氮保存，后移入-80℃低温冰箱保存作Real-time PCR备用。　　3、各组大鼠的心肌病理学检查　　取出各组40g/L多聚甲醛固定的心肌组织，进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。在光镜下观察各组心肌细胞的炎性浸润和心肌坏死情况，每张心肌组织切片随机选取5个高倍视野。　　4、免疫组化检测各组大鼠RyR2表达情况　　取出各组40 g/L多聚甲醛固定的心肌组织，进行石蜡包埋、切片、组化前准备、血清封闭、加一抗RyR2(1∶100)、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、封片剂封片，光镜下观察各组心肌细胞。用医学分析软件Image Pro Plus6.0测量照片面积和累积光密度(IOD)并计算，用SPSS软件分析数据。　　5、Realtime-PCR检测各组大鼠心肌RyR2mRNA表达水平　　取出-80℃冷冻保存的心肌组织，在EP管中加入50mg组织与1mlTrizol剪碎心肌组织提取细胞沉淀中的总RNA，所得总RNA通过琼脂糖凝胶电泳来检测RNA的完整性和纯度，紫外分光光度计测定总RNA的浓度及纯度，构建大鼠RyR2mRNA引物及荧光探针，进行PCR扩增，逆转录合成cDNA。扩增前新鲜稀释阳性模板，取不同梯度上机，绘制荧光定量RT-PCR检测标准曲线。根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果，得出每微克总RNA中待测mRNA的拷贝数。　　6、统计学处理　　采用SSPS12.0软件进行分析，计量资料以(x)±s表示，同组不同时间点采用单因素方差分析，两组比较采在方差齐情况下用T检验（若方差不齐用K个样本独立检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。　　实验结果:　　1、脓毒性休克大鼠模型建立　　脓毒性休克组大鼠在给予LPS后血压会出现暂时下降，稳定之后会有所上升，在给药后2小时左右，平均动脉压比基础值下降25％-30％，为脓毒性休克，此时可观察到大鼠四肢末梢发绀的现象。生理记录仪观察MAP血压变化，对照组与脓毒性休克组相应时间点比较均具有统计学意义(P＜0.01)，对照组各时间点与0h的基础值比较无统计学意义(P＞0.05)。脓毒性休克组大鼠各时间点MAP与休克0h比较具有统计学意义(P＜0.01)，可以说明此方法制作脓毒性休克模型，给药2小时左右成模并具有稳定性，　　2、各组大鼠心功能改变结果　　2.1.左室舒张末压变化　　动态检测大鼠左心功能，可发现脓毒性休克大鼠心功能障碍逐渐加重。休克组大鼠左室舒张末压(LVEDP)随休克时间的延长有上升趋势。对照组大鼠LVEDP随插管时间变化波动不大。休克组各时间点与对照组对应各时间点比较均具有统计学差异(P＜0.01)。休克组各时间点与休克0h组LVEDP比较具有统计学意义(P＜0.05)。对照组各时间点与0h组LVEDP比较不具有统计学意义(P＞0.05)。　　2.2.左心室内压改变速率变化　　观察大鼠收缩期左心室收缩内压上升最大速率(+dp/dt max)和舒张期左心室内压下降最大速率(-dp/dt max)。发现休克大鼠+dp/dt max和-dp/dt max随休克时间延长明显下降，同组不同时间点与基础值比较均具有统计学意义（P均＜0.01）。对照组大鼠+dp/dt max和-dp/dt max随插管时间变化波动不大，同组不同时间点与基础值比较均不具有统计学意义（P均＞0.05）。休克组+dp/dt max和-dp/dt max各时间点与对照组对应各时间点比较均具有统计学差异(P＜0.01)。　　3、大鼠心功能改变时心脏组织病理学变化　　在光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织的心肌结构以及心肌细胞形态。对照组、休克0h组心肌结构基本正常，细胞形态也未见明显异常。休克2h、4h、6h随着休克时间延长，心肌组织结构紊乱，休克6H可明显观察到肌间组织断裂，心肌细胞崩解，细胞核溶解。　　4、大鼠心肌组织中RyR2免疫组织化学定位、总量表达水平及磷酸化变化及随心功能变化的改变　　免疫组化结果显示，大鼠心肌组织RyR2主要定位于心肌细胞细胞质。对照组染色较少，脓毒性休克各个时间点心肌组织内RyR2的相对蛋白表达水平除6h组明显高于对照组相对应的各个时间点（P均＜0.01）。脓毒症休克后随LPS给药时间延长RyR2的蛋白表达水平逐渐下降趋势(P＜0.01)。对照组各时间点与基础值比较化蛋白表达水平略微上升(P＜0.05)。RYR2磷酸化水平随休克时间延长逐渐上升(P均＜0.01）。对照组各时间点与基础值比较化蛋白表达未见明显改变(P＞0.05)。　　5、大鼠心肌组织中RyR2 mRNA表达随心功能变化的改变　　与脓毒症时RyR2水平变化趋势不同，脓毒症休克0h、2h、4h RYR2 mRNA的相对表达水平明显高于休克6h组(P＜0.01)。RyR2 mRNA的相对表达量在大鼠休克0h达到高峰，随着休克时间的延长RyR2 mRNA的表达水平逐渐下降。对照组各时间点与基础值比较mRNA表达水平略微上升但并未见明显差异(P＞0.05)。脓毒症休克各时间点（除6h组）mRNA表达水平显著高于对照组相对应的各个时间点（P均＜0.01），6h组mRNA表达水平休克组与对照组未见明显差异(P＞0.05)。　　结论:　　1、本研究通过静脉注射LPS的方法成功建立脓毒性休克大鼠模型，且随着给药时间延长，心肌损伤逐渐加重，左心功能随时间延长而成持续下降趋势。　　2、LPS诱导大鼠脓毒症休克后，随给药时间延长，RyR2相对数量下降。　　3、LPS诱导大鼠脓毒症休克后，随给药时间延长，磷酸化RyR2比例有所上升。