第一部分: AEG-1在神经母细胞瘤中的表达及其对预后的影响 1.目的: （1）检测AEG-1在神经母细胞瘤中的表达 （2）研究AEG-1的表达与神经母细胞瘤临床病理参数的关系及其对预后的影响 （3）明确AEG-1在神经母细胞瘤细胞中的定位 2.材料与方法: （1）收集病例资料：收集山东大学齐鲁医院接受手术并病理证实的神经母细胞瘤标本32例，详细记录病人的资料，并进行随访。 （2）研究AEG-1在神经母细胞瘤组织的表达：免疫组织化学法。 （3）明确AEG-1在神经母细胞瘤细胞中的定位：免疫荧光标记法。 3.结果: （1）AEG-1在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75％（24/32例）标本为阳性表达。 （2）对32例神经母细胞瘤患者的临床资料进行x2检验，研究AEG-1与临床病理参数之间的关系。年龄<1岁的患者中AEG-1阳性率为37.5％（3/8），年龄≥1岁患者中AEG-1阳性率为87.5％（21/24），二者相比有显著性差异（P=0.012），年龄≥1岁组AEG-1表达水平高于年龄<1岁组；男性患者中AEG-1阳性率为77.8％（14/18），女性患者中AEG-1阳性率为71.4％（10/14），二组无显著性差异（P=0.703）；原发部位为肾上腺的患者中AEG-1阳性率为78.9％（13/19），发病部位为肾上腺以外的患者中AEG-1阳性率为69.2％（11/13），二组无显著性差异（P=0.420）；处于疾病早期（Early stage）（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者中AEG-1阳性率为50％（5/10），处于进展期（Advanced stage）（Ⅲ+Ⅳ）患者中AEG-1阳性率为90％（18/20），二组相比有显著性差异（p=0.03），进展期AEG-1表达水平高于早期；根据国际神经母细胞瘤病理分型，组织结构良好型（Favourable histology，FH）的患者中AEG-1阳性率为58.8％（10/17），组织结构不良型（Unfavourable histology，UFH）患者中AEG-1阳性率为93.3％（14/15），二组相比有显著性差异（P=0.041），UFH患者AEG-1表达水平高于FH。 （3）Spearman相关性分析，AEG-1表达与患者的发病年龄（r=0.404，P=0.022）、临床分期（r=0.447，P=0.010）、病理分型（r=0.389，P=0.024）呈正相关。 （4）对32例神经母细胞瘤患者进行单因素Kaplan-Meier分析，再用Log-rank检验两组生存率的统计意义，研究与神经母细胞瘤预后相关的因素。 （5）Cox多因素分析结果，国际神经母细胞瘤病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素（P=0.022）；AEG-1的表达（P=0.176），年龄（P=0.247），临床分期（P=0.694）不是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核内没有AEG-1的表达。 4.结论: （1）AEG-1在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75％（24/32例）标本为阳性表达。 （2）AEG-1的表达在不同的发病年龄、临床分期、病理类型的患者之间有显著性差异，而在不同的性别、不同发病部位的患者之间没有显著性差异。 （3）Spearman相关性分析，AEG-1表达与患者的发病年龄、临床分期、病理分型呈正相关。 （4）对32例神经母细胞瘤患者进行单因素Kaplan-Meier分析，再用Log-rank检验两组生存率的统计意义。AEG-1的表达、病人的发病年龄、临床分期和病理分型对患者预后的影响具有统计学意义，而病人的性别和起病的部位对患者的预后没有影响。 （5）Cox多因素分析结果，病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核内没有AEG-1的表达。 第二部分:慢病毒介导的神经母细胞瘤细胞AEG-1基因沉默 目的: （1）构建AEG-1 RNA干扰慢病毒载体 （2）筛选AEG-1基因沉默的细胞株 （3）比较AEG-1基因沉默的效果 材料与方法: （1）AEG-1 RNA干扰慢病毒载体的构建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iTLentiviral RNAi Expression System，构建入门克隆和病毒包装目的质粒。 （2）RNA干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染293FT的方式生产病毒，病毒功能滴度测定用转导试验，分子滴度测定用定量PCR技术。 （3）基因沉默细胞株的筛选：慢病毒转导M17和SK-N-SH细胞后用Blasticidin筛选，建立AEG-1基因沉默细胞株和对照细胞株。 （4）细胞瞬时转染实验：用Lipofectamine2000进行转染试验，评价RNAi效果。 （5）AEG-1 mRNA表达水平的分析：定量RT-PCR。 （6）AEG-1蛋白表达水平的检测：Western Blot分析。 3.结果: （1）成功构建AEG-1RNAi入门质粒，两个针对不同序列的RNAi质粒均有显著的干扰效果，AEG-1mRNA抑制效果分别达53.7％和61.1％。 （2）包装产生的浓度为2×1010copies/ml的Lenti6-AEG-1和Lenti6-NS转导M17、SK-N-SH细胞的功能滴度分别为：1.8×106TU/ml、1.2×106TU/ml和1.7×106TU/ml、1.2×106TU/ml。 （3）成功筛选出AEG-1基因沉默的M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）细胞，同时建立非特异性对照细胞M17/NS和SK-N-SH/NS。 （4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1mRNA水平约下降80％，M17/NS和SK-N-SH/NS的AEG-1mRNA水平与亲本细胞相比无明显改变；M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1蛋白质水平约下降90％。 4.结论: （1）成功构建AEG-1 shRNA表达质粒，并比较针对不同靶序列的RNAi质粒的效果，确定RNAi效果较好的靶序列。 （2）采用BLOCK-iT慢病毒RNA干扰系统，成功构建并包装生产较高滴度的慢病毒载体。 （3）应用病毒转导加Blasticidin筛选的方式，成功建立AEG-1基因稳定沉默的M17和SK-N-SH细胞及非特异性病毒转导细胞。 （4）定量RT-PCR和Western Blot分析结果表明筛选细胞AEG-1基因mRNA水平显著抑制，蛋白质水平明显下降。 第三部分:AEG-1基因沉默对神经母细胞瘤的生物学行为的影响 1.目的: （1）观察AEG-1基因沉默对细胞增殖的影响 （2）分析AEG-1基因沉默对细胞周期的影响 （3）探讨AEG-1基因沉默对凋亡的影响 （4）研究AEG-1基因沉默对肿瘤细胞侵袭的影响 （5）分析AEG-1基因沉默对细胞化疗敏感性的影响 2.材料与方法: （1）细胞增殖实验：采用MTT法和克隆形成实验评价AEG-1基因沉默对细胞增殖的影响。 （2）细胞周期分析：用流式细胞技术测定细胞DNA含量，Modtif软件分析细胞周期。 （3）细胞凋亡实验：采用Annexin-V和PI双染流式细胞仪分析AEG-1基因沉默对细胞的凋亡情况的影响。 （4）细胞侵袭能力实验：Transwell侵袭试验。 （5）化疗敏感性实验：MTT法测定细胞对化疗药物敏感性的差异。 3.结果: （1）AEG-1基因沉默细胞增殖分别降低45.1％，57.4％，明显慢于亲本细胞，克隆形成率分别降低43.5％，56.7％；非特异性对照转染的细胞增殖未受明显影响。 （2）AEG-1基因沉默细胞G0/G1期细胞增加29.3％，26.9％，与亲本细胞相比有显著性差异。 （3）AEG-1基因沉默细胞的凋亡率增加7.5％和6.4％。 （4）AEG-1基因沉默的细胞穿过膜的能力降低56.8％，50.0％，明显低于亲本细胞和对照细胞（P<0.01） （5）AEG-1基因沉默细胞对化疗药物的敏感性明显增加。 4.结论: （1）AEG-1能促进神经母细胞瘤细胞增殖和抑制凋亡。 （2）AEG-1基因沉默可以通过将细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖。 （3）AEG-1能促进肿瘤细胞的侵袭。 （4）AEG-1基因沉默可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。