可追溯在保证食品质量安全,保护消费者合法权益等方面具有重要作用,然而目前的耳标和标签系统无法确保从动物饲养—屠宰—加工—销售各环节追溯信息的真实性。而DNA溯源技术因其稳定及不可更改的特性,为实现“物码合一”的验证及溯源链条的无缝链接提供了新的技术手段。因此,本研究开展了基于SNP和SSR标记的牛肉产品溯源鉴定技术研究,为今后DNA溯源技术的推广应奠定基础。主要内容及研究结果如下:1.同步收集DNA样本的动物耳标研制。荧光定量PCR方法考察滤纸等收集载体对血斑样本保存的稳定性,优选了Whatman903#样本收集纸作为最终样本收集载体。采用12.5丝的热裱膜对收集载体进行热封保护后固定于经改造的动物耳标公订柱上。该耳标实现了动物个体信息记录及DNA样本采集的双重功能,为溯源样本库的建立提供便利。2.用于牛肉及产品溯源应用的SNP标记筛选。根据NCBI dbSNP数据库,以市场上常见的7个品种共计176个个体作为测试样本,采用二代测序技术对初选的59个位点进行多态性分析,获得了MAF大于0.3的位点36个,12个多态性最高的位点组合可实现两个随机个体的误判概率不高于百万分之三。通过性状基因进行位点筛选,以市场上最常见的4个肉牛品种共计16个样本为测试样本,PCR扩增基因相关片段后进行Sanger测序,获得多态性位点61个,位点用于溯源应用的区分效果需根据应用群体进一步验证。3.两种简便的SNP分型检测方法建立。基于AS-PCR-CE的高通量的分型检测方法,设计等位基因特异性PCR引物,扩增模板后经毛细管电泳分离,根据条带的“有”/“无”判定基因型,该方法的灵敏度为0.4ng/μL。基于胶体金—RPA的快速可视化的分型检测方法,设计RPA引物,利用链霉亲和素—生物素系统对扩增产物进行检测,通过试纸条T、C线来判定样本基因型,该方法的灵敏度为14ng/μL。4.SNP标记用于牛肉产品的溯源应用研究。分别采集来源于具有完善产品追溯系统及只具有记录系统的两家肉牛养殖加工企业的样本,利用来源于性状基因的多态性较高的12个SNP位点组合进行基因分型测定,通过肉样及血液样本的12位基因型条码比对实现对企业溯源系统记录真实性及样本来源个体的准确判定。5.SNP标记用于牦牛肉与普通牛肉的鉴定研究。根据性状相关基因挑选了等位基因频率在普通肉牛群体中为0.546-0.833、在牦牛群体中为0.009-0.075的10个SNP位点,样本经PCR扩增,毛细管电泳分离后,根据出峰数目进行肉源判定。牦牛肉样本出峰数目在1-3个之间,普通牛肉样本出峰数目在5-10之间,该方法灵敏度为0.3ng/μL。6.SSR标记用于牛肉产品的溯源应用研究。以市场上常见的6个品种的共计100个个体作为测试样本,通过荧光多重PCR及毛细管电泳对候选的16个标记位点进行多态性分析,6个多态性最高的位点组合可实现两个随机个体的误判概率不超过百万分之二,与数据库获得的12个SNP位点的区分效果相当。PLS-DA分析表明,该16个位点可以很好地将受试的6个品种区分开。