任何类型肿瘤的发生都离不开基因调控的异常,肝细胞癌的发生也不例外,但是如何在众多基因中筛选出与特定肿瘤发生密切相关的靶基因是肿瘤基因研究的难点和热点。我们首先采用基因筛选的技术寻找与肝细胞癌发生和发展可能具有直接联系的敏感性基因FEN1,并通过临床和细胞实验进一步验证,这是文章的第一部分。越来越多的研究发现,无论是靶向促癌基因还是抑癌基因,均不能有效抑制肿瘤细胞的增殖活性,遗传基因的转录和蛋白的功能表达还受到真核生物体内多种非遗传物质的影响,包括长链非编码RNAs和microRNAs。接下来我们试图分析lncRNA CYTOR影响肝癌细胞FEN1基因表达及细胞凋亡和自噬的机制,这是文章的第二部分。紧接着深入探讨microRNA-378a影响肝癌FEN1基因表达调控细胞恶性生物学行为以及相关信号通路的机制,这是文章的第三部分。尽管该研究结果不能很好证实 lncRNA CYTOR-microRNA-378a-FEN1是否能够构成竞争性网络调控机制参与肝癌细胞的发生和发展过程,但是为肝癌的靶向调控理论和临床干预提供了重要思路。最后,第四部分文章分析了原发肝细胞癌FEN1基因表达与细胞胰岛素抵抗、氧化应激、能量代谢以及衰老发生的关系,进一步揭示了肝癌细胞功能障碍与肿瘤间的关系。第一部分 肝癌中FEN1上调与肿瘤进展和预后相关背景原发性肝细胞癌发现时往往处于晚期,预后较差。有文献报道FEN1在多种恶性肿瘤中高表达,在肿瘤进展过程中发挥重要的作用。目的通过对多个肝癌队列中FEN1的mRNA和蛋白水平的表达进行研究,以探讨FEN1在肝癌进展过程中的作用,为肝癌的诊断和判断预后提供可能的标志物。方法通过TCGA数据库和GEO数据库中肝细胞癌mRNA的表达水平来研究FEN1的表达。用免疫组化的方法对396例肝细胞癌病例的组织芯片进行分析以证实FEN1在肝细胞癌中的表达。使用Kaplan-Meier分析、单因素多因素方差分析来探究FEN1表达与肝细胞癌患者生存率之间的关系。通过功能和通路富集分析来预测FEN1在肝细胞癌中发挥作用的分子机制。用体外试验来探究FEN1在肝癌细胞中的生物学功能。结果我们发现FEN1在多个肝细胞癌队列中高表达,无论是mRNA水平还是蛋白质水平。ROC曲线显示FEN1可以用作肝细胞癌的诊断预测因子。同时,高FEN1表达水平的患者比低FEN1表达水平的患者有较短的全因生存期和无复发生存期。更重要的是,通过单因素和多因素分析,我们发现FEN1表达水平是肝细胞癌患者全因生存率和无复发生存率的独立预测因子,预示着FEN1可能是肝细胞癌的潜在诊断因子。另外,通过体外试验检测c-Myc,Survivin和Cyclin D1的表达,发现FEN1的敲除抑制细胞的增殖和迁移,预示着FEN1通过调控细胞周期和DNA复制通路发挥着癌基因的功能。结论:FEN1是肝细胞癌的癌基因,可以作为诊断和预后标记物。第二部分 lncRNA CYTOR影响肝癌细胞FEN1基因表达及细胞凋亡和自噬的机制背景研究表明,肿瘤基因组95%以上为非编码功能的RNAs,包括微小RNAs(mi RNAs)和长链非编码 RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)两类,通过 lnc RNAs-miRNAs-mRNAs形成复杂的关系网络,共同影响DNA分子的转录、翻译以及蛋白功能的表达,在多种疾病,尤其是肿瘤的增殖、分化、侵袭、转移、凋亡及自噬等多种生物学行为中发挥重要作用。随着研究的深入,lncRNAs在肿瘤发生和发展中的作用被逐渐认识,通过基因芯片、全基因组测序及肿瘤代谢组学等高通量技术可以筛选到与肿瘤密切相关的多种lncRNAs差异性表达,通过荧光素酶报告实验验证lncRNAs的靶向miRNAs或mRNAs,通过多种自动化生物富集信息技术探寻在细胞内的主要生物学功能,为疾病的发生机制提供较完整的“反应链”。长链非编码RNA细胞骨架调节剂(Long non-coding RNA cytoskeleton regulator,CYTOR)也称为Linc00152,是首先在肝癌发生的研究中被发现,主要扮演促癌角色增强肝癌细胞的增殖活性,抑制其凋亡进程;在人体肝癌组织中往往表达上调与肿瘤临床TNM分期增加、早期淋巴或血液转移、放化疗耐药性增强、较差的生存预后等有重要联系。CYTOR在其他多种恶性肿瘤,如胃癌、乳腺癌、结直肠癌等中也有异常表达,在不同的肿瘤中或上调或下调,发挥不同的作用。考虑可能与组织特性、靶向基因的不同有关。本研究第一部分已经指出,肝癌细胞和组织中FEN1基因表达上调与肿瘤的恶性程度增强以及临床预后更差有直接关系。因此,我们推测lncRNACYTOR可能影响肝癌细胞FEN1基因的表达,调节细胞的凋亡和自噬活性,进而参与肝癌的发生过程。目的通过人体肿瘤组织和体外细胞实验验证肝癌细胞和组织中CYTOR表达上调能够影响FEN1基因的表达以及细胞的凋亡和自噬活性,为肝癌的发生机制和基因靶向治疗提供理论依据。方法首先本研究第一部分获得的肝癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测CYTOR和FEN1基因表达水平,Pearson检验分析相关性。然后利用肝癌Hep-G2细胞株,体外构建CYTOR上调、下调和空质粒并转染Hep-G2,RT-qPCR法检测转染效率,选择稳定表达的细胞系,培养48h后RT-qPCR法检测细胞FEN1基因表达,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡分子Caspase-9、bcl-2和bax蛋白水平,免疫荧光检测自噬小体数量,RT-qPCR法检测自噬基因Beclin-1、微管相关蛋白1A(LC3)mRNA水平。结果肿瘤组织中CYTOR和FEN1表达水平明显高于癌旁正常组织,Pearson检验发现,CYTOR和FEN1表达水平呈正相关(P<0.05)。与空质粒转染组相比,CYTOR上调组Hep-G2细胞中CYTOR和FEN1表达水平显著升高,细胞凋亡率下降,凋亡分子Caspase-9、bcl-2和bax蛋白表达水平降低,自噬小体数量减少,自噬基因Beclin-1和LC3 mRNA表达水平也下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而CYTOR下调组细胞中CYTOR和FEN1表达水平显著降低,细胞凋亡率增加,Caspase-9、bcl-2和bax蛋白表达水平升高,自噬小体数量增多,Beclin-1和LC3 mRNA表达水平也增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肝癌组织和细胞中lncRNACYTOR表达升高,可能影响FEN1基因表达,进而抑制细胞的凋亡和自噬活性,参与肝癌的发生过程。第三部分 microRNA-378a影响肝癌FEN1基因表达调控细胞恶性生物学行为以及相关信号通路的机制背景microRNAs作为真核生物体内广泛分布的一类非编码RNA,被证实在靶向沉默转录基因表达,在多种生理和病理改变中发挥重要作用,尤其与肿瘤的发生和发展过程密切相关。经高通量基因测序筛选发现,microRNA-378a(miR-378a)在肝癌组织和细胞中表达上调,与肿瘤的多个临床特征如TNM分期、淋巴结和血液转移、组织分化级别、化疗耐药性以及生存结局具有直接相关性。miR-378a可能通过靶向沉默一个或多个转录基因参与肿瘤的恶性生物学行为调控过程。我们推测miR-378a可能与FEN1基因表达存在靶向调控关系。目的探讨miR-378a在肝癌细胞中表达与FEN1基因的靶向调控关系,是否影响细胞增殖和周期分布、炎症因子表达和血管新生,以及转化生长因子(TGF)-β和核转录因子(NF-κB)信号通路的激活机制。方法选择肝癌细胞株Hep-3b和Hep-G2,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术准确敲除 miR-378a 基因,构建 PX458-miR-378a-sg RNA1 和 PX459-miR-378a-sg RNA2重组质粒,共转染至Hep-3b和Hep-G2细胞中,培养得到稳定的单克隆细胞株,基因测序和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-378a表达进行鉴定。实验分组:Hep-3b和Hep-G2细胞正常培养组(对照组)、miR-378a基因敲除转染Hep-3b和Hep-G2细胞组(miR-378a敲除组),各组分别培养48h后,采用RT-qPCR法检测FEN1基因表达,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期分布,ELISA法检测细胞培养液炎症因子IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达,Western blot法检测血管新生的关键蛋白分子缺氧诱导因子(HIF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达,Western blot法检测信号通路TGF-β和NF-κB蛋白的表达。结果经基因测序和 RT-qPCR 法证实,PX458-miR-378a-sg RNA1 和 PX459-miR-378a-sg RNA2重组质粒共转染Hep-3b和Hep-G2细胞后,miR-378a表达量显著降低(P<0.05),达到了基因敲除的目的;并筛选出稳定低表达的单克隆细胞株。培养48h后,与Hep-3b和Hep-G2对照组比较,miR-378a敲除组FEN1基因表达量显著升高,细胞增殖率增加,细胞周期中G2/M期百分比增多,炎症因子IL-6和TNF-α表达水平增加,血管新生蛋白HIF-α和VEGF表达量增加,信号通路TGF-β和NF-κB蛋白升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。Hep-3b和Hep-G2对照组间比较、Hep-3b和Hep-G2的miR-378a敲除组间比较,上述指标差异均不明显(P>0.05)。结论miR-378a表达升高可能参与肝癌的发生,通过靶向沉默细胞FEN1基因表达,进而影响细胞增殖活性和分裂周期分布、炎症因子表达和血管新生,可能介导TGF-β和NF-κB信号通路的激活发挥相关作用。miR-378a或许是肝癌靶向治疗的重要潜力位点。第四部分 原发肝细胞癌FEN1基因表达与细胞胰岛素抵抗、氧化应激、能量代谢以及衰老发生的关系背景我们前期研究已经探讨了 FEN1基因在原发肝细胞癌中存在异常表达,可能与LncRNA-miRNA构成复杂的关系网络,调控细胞的增殖、凋亡、自噬、侵袭和转移等恶性行为。基因的功能表达最终需要落实到细胞的生长和代谢过程中,肝细胞是机体主要的物质和能量代谢场所。越来越多的研究指出,肝癌的发生与2型糖尿病之间存在密切联系,两者可相互作用,促进疾病的发生。高糖环境可增加细胞胰岛素抵抗的发生、多种促癌活性因子表达、糖基化产物对细胞直接产生毒性作用以及强烈的氧化应激反应等。基于此,该研究主要探讨FEN1基因是如何影响肝癌细胞的生长代谢过程的。目的分析原发肝细胞癌FEN1基因表达与细胞胰岛素抵抗、氧化应激、能量代谢以及衰老发生的关系,进一步阐述FEN1基因异常表达与肝癌发生的内在联系。方法选择肝癌Hep-G2细胞株体外培养,实验分成四组:空白对照组、低浓度葡萄糖干预组(1mmol/L)、中浓度组(5mmol/L)和高浓度组(10mmol/L),共同培养72h,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测FEN1基因表达,Western blot法检测胰岛素抵抗相关蛋白-细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IG-FBP)和晚期糖基化终末产物(AGEs),肿瘤发生相关蛋白-血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子(TGF),细胞衰老相关蛋白-β半乳糖苷酶(β-Gal)和缺氧诱导因子(HIF)-lα,细胞内铁死亡通路蛋白质谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达,放射免疫法检测氧化应激指标活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平,分光光度法检测能量代谢指标己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)活力以及腺苷三磷酸(ATP)的含量。结果与对照组和低浓度组相比,中浓度组和高浓度组肝癌细胞FEN1基因表达水平明显升高,IG-FBP和AGEs、VEGF和TGF、β-Gal和HIF-1α以及GPX4蛋白表达均显著增加,ROS、SOD、MDA和GSH水平升高,HK和PK活力以及ATP含量也明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度组上述指标也明显高于中浓度组(P<0.05),但对照组和低浓度组相比差异不明显(P>0.05)。结论高糖环境能够诱导肝癌细胞FENI基因表达,影响细胞胰岛素抵抗、诱导肿瘤发生、调节细胞衰老机制、影响细胞能量代谢、氧化应激以及铁相关代谢,为肝癌的发生机制和针对性干预提供了重要依据。