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目的:1.探讨胃神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasm,NEN)的临床病理特征和预后因素。2.检测胃混合性腺神经内分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma,MANEC)两种成分的基因突变及拷贝数异常,探究胃MANEC的发生和进展机制。方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院2011年3月至2017年12月收治的胃NEN,并进行复核,依据WHO 2010版分类,分析比较不同分类胃NEN的临床病理特征,并进行生存分析。2.选取“碰撞型”胃MANEC,分别从腺癌成分、神经内分泌癌成分和配对的癌旁样本中提取DNA,进行全外显子组测序。利用in-house软件检测癌旁样本的基因突变,筛选可能的癌症易感基因。以配对的癌旁组织作为对照,检测神经内分泌成分和腺癌成分的体细胞基因突变,利用MuSiC软件和in-house软件分别筛选高频突变基因和潜在突变基因。将以上突变基因特征分别进行两种成分的组间比较和同一病例的配对比较。3.利用Sanger测序,对胃MANEC的神经内分泌成分和腺癌成分的DNA分别验证特定基因TP53外显子5,6,7和8的基因突变。4.利用OncoScan FFPE Assay Kits(Thermo),对胃MANEC的神经内分泌成分和腺癌成分的DNA分别进行拷贝数变异检测。挑选出所有改变的染色体臂以及位于臂上的基因,进行分层聚类。将以上拷贝数变异特征分别进行两种成分的组间比较和同一病例的配对比较。5.利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)验证特定基因CCNE1的拷贝数变异,并利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色技术检测细胞周期蛋白E(cyclin E)的蛋白表达水平。6.将胃MANEC两种成分的突变基因和拷贝数变异相关基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,筛选显著的分子通路,以探索胃MANEC的发生发展机制。结果:1.117例胃神经内分泌肿瘤的临床病理特征和预后分析1.1在通过复核确诊的117例胃NEN中,神经内分泌瘤(neuroendocrine tumor,NET)G1、NET G2、神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma,NEC)和MANEC分别为13例(11.1%)、6例(5.1%)、57例(48.7%)和41例(35.1%)。1.2.胃NET G1/G2以多发肿物为主,肿物直径小,浸润深度浅,淋巴结转移和远处转移很少见,确诊时分期较早;治疗方式包括胃镜粘膜下剥离术和根治性手术切除;大多数胃NET G1/G2包含NET的前驱病变;患者的预后较好。1.3胃NEC和胃MANEC以单发肿物为主,肿物直径大,浸润深度深,淋巴结转移和远处转移多见,确诊时多为进展期;全部患者行手术切除,且大部分进行了辅助治疗;胃NEC以大细胞型和差分化为主,胃MANEC的神经内分泌和腺癌成分组成形式多样;胃NEC和MANEC患者的预后均较差,但影响两者无进展生存期(progression-free survival,PFS)和总体生存期(overall survival,OS)的预后因素不同。远处转移和随访期间复发或转移分别是提示胃NEC PFS和OS差的独立预后因素;淋巴结转移和远处转移是提示胃MANEC PFS差的独立预后因素,淋巴结转移还是提示胃MANEC OS差的独立预后因素。2.胃MANEC的分子特征2.1选取8例“碰撞型”胃MANEC,7例进行了全外显子组测序分析(1例建库失败),8例进行了拷贝数变异分析。2.2癌旁组织可检测到较多基因突变,包括BPTF、ZFHX3、MAP3K1等。体细胞基因突变类型以碱基置换(C→T/G→A)为主。神经内分泌成分和腺癌成分的体细胞基因突变频率,在组间比较和配对比较中都没有显著差异(P>0.05)。TP53在神经内分泌成分和腺癌成分中均为高频突变基因和潜在驱动基因,也是同一病例两种成分中最高频的共性突变基因,并得到Sanger测序的证实。2.3对染色体拷贝数变异的聚类分析显示,不同病例中的腺癌成分首先聚集在一起,而不同病例中的神经内分泌成分不聚集。神经内分泌成分的染色体拷贝数变异数目显著大于腺癌成分(P=0.007)。4例胃MANEC病例的两种成分中检测到染色体19q12上CCNE1基因的扩增,是配对比较最常见的拷贝数变异,并得到qRT-PCR和FISH的证实,且IHC染色也证实CCNE1编码的cyclin E在两种成分中均呈弥漫阳性。2.4对神经内分泌成分和腺癌成分的突变基因和拷贝数变异相关基因进行KEGG通路富集分析的结果显示,异常基因富集在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、神经相关通路(Neuroactive ligand-receptor interaction,Axon guidance,Neurotrophin signaling pathway,Glutamatergic synapse)、细胞周期(cell cycle)和肌动蛋白细胞骨架调控(Regulation of actin cytoskeleton)通路。神经内分泌成分和腺癌成分中的突变基因富集的通路种类没有差别,而神经内分泌成分拷贝数变异相关基因更集中地富集在MAPK信号通路、神经相关通路和细胞周期通路中。结论:1.胃NEN是一组异质性肿瘤,不同分类的胃NEN具有不同的临床病理特征,并且预后也存在差异。需要多中心大样本研究来完善胃NEN的分类,并探索预后相关因素。2.对胃“碰撞型”MANEC两种成分的分子遗传学检测结果提示,MANEC的腺癌和神经内分泌癌成分更可能起源于同一内胚层多潜能干细胞,在发生过程中TP53等基因突变可能起了较大的作用,CCNE1基因扩增等拷贝数异常也可能出现于肿瘤发生早期;在向腺癌和神经内分泌癌不同方向的分化过程中,拷贝数变异可能发挥更大的作用。由于标本数量的限制,以上结论需要在更大样本中进一步验证。