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丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)属于唇形科鼠尾草属植物,因其干燥的根和根茎中的活性成分而常被作为一种药用植物来研究,在医治心脑血管类疾病、抗氧化及抗肿瘤等问题上有显著疗效。现今研究人员大多关注于对丹参次生代谢中二萜类化合物丹参酮的研究,而对丹参中三萜类化合物的相关代谢研究甚少,但是丹参中也含有许多具有药用活性的三萜类化合物,所以对三萜类化合物代谢途径的解析还有待研究。本文在前期建立的丹参转录组数据库的基础上,对转录组进行深度挖掘,获得了一个2,3-环氧角鲨烯环化酶的unigene序列,进一步通过RACE技术得到2,3-环氧角鳘烯环化酶的cDNA全长序列,并对这条2,3-环氧角鲨烯环化酶进行克隆及功能鉴定。主要结果如下:1.从丹参中克隆得到了一个2,3-环氧角鲨烯环化酶基因SmOSC,全长为2298bp,编码765个氨基酸残基,经序列比对和进化树分析,推测这条基因可能在三萜类化合物的生物合成中编码2,3-环氧角鲨烯环化酶。进一步进行生物信息学分析,通过PSORT在线服务器对SmOSC进行了亚细胞定位分析,应用ExPASy Proteomics Server中Protparam在线软件对蛋白进行了理化性质的预测分析,最后利用predictprotein及Swiss-model生物学软件分别预测该基因可能编码的蛋白质二级和三维结构并建立结构模型,结果发现丹参中的SmOSC与人参中的三萜环化酶PgDDS具有很高的同源性。2.通过Gateway的方法,将SmOSC基因先通过BP反应构建到入门载体pDonr207中,再通过LR反应,重组到pAg1423酵母表达载体上,再转化Y21900酵母突变菌株。通过酵母发酵,进行体内的酶活反应后,提取酵母中的产物进行检测分析。利用高效液相色谱及Q-Exactive(QE)质谱仪对化合物进行分析,结果显示产物为达玛烯二醇(DM Ⅱ)。3.以微生物作为底盘细胞进行的研究比较普遍,而本文在酵母体系研究的基础上,又考虑植物底盘,模式植物本氏烟草(Nicotianabenthamiana)因为其生长周期短而被作为理想的研究对象。选取在温室中生长6周的本氏烟草对SmOSC进行瞬时表达。利用Gateway的方法构建表达载体pEAQ-SmOSC,通过农杆菌GV3101介导转化本氏烟草。瞬转后在温室正常生长4天后,用甲醇进行提取,并通过QE检测其产物,结果能够检测到DM-Ⅱ,而对照中则检测不到DM-Ⅱ,说明SmOSC在烟草体系中能够催化生成DM-Ⅱ。4.运用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术,研究SmOSC在丹参的根、茎、叶和花中基因表达的差异性。首先对不同组织的RNA进行提取,设定Actin为内参基因。结果显示SmOSC在丹参的叶和花中表达较高,各组织的表达量从大到小依次是花>叶>茎>根,即在丹参地上部分SmOSC的转录表达水平较高,其在花、叶中表达量约是茎、根中表达量的3.6倍。我们推测这可能与植物的逆境胁迫有关。为了证实这一推测,我们随后进行了激素诱导的表达实验,即向丹参植株施加外源激素茉莉酸甲酯(MJ)、乙烯(ET)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和水杨酸(SA),诱导处理2h后,提取叶中RNA,对SmOSC进行实时荧光定量PCR分析,结果发现与对照CK相比,SmOSC在脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯的调节下,其表达明显受到抑制,而在乙烯诱导下的表达量没有明显的变化,说明脱落酸、水杨酸、赤霉素及茉莉酸甲酯等介导的胁迫途径能够影响丹参中SmOSC的表达。