马铃薯帚顶病毒遗传进化分析及其侵染性克隆的构建

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马铃薯帚顶病毒(potato mop-top virus,PMTV)属于帚状病毒科(Virgaviridae),是马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)的模式种,主要通过马铃薯粉痂菌进行传播。PMTV侵染马铃薯后,引起马铃薯薯块的坏死,给马铃薯产业带来了严重的经济损失。在我国,PMTV属于进境植物检疫性有害生物。部分地区已检测到该病毒,但种薯携带PMTV情况还不清楚。本研究通过检测不同马铃薯品种种薯携带马铃薯粉痂菌和PMTV情况,克隆了PMTV中国分离物全基因组序列并进行了系统进化分析,构建了PMTV侵染性克隆并优化接种方法。具体结果如下:(1)检测到3个马铃薯品种种薯携带粉痂菌情况。利用粉痂菌特异性引物检测了5个品种67个薯块携带马铃薯粉痂菌情况,并对检出粉痂菌的薯块进行病情调查。结果发现,共有3个马铃薯品种42个种薯薯块检测到粉痂菌,其中希森6号的粉痂菌检出率最高(88.89%),冀张薯12号和大白花的发病率分别为47.61%、43.06%;通过病情分级,确定三个品种的病情指数依次为64.58、47.61、43.06。(2)明确了8个品种39个种薯携带PMTV。利用PMTV特异性引物检测了来源于内蒙古自治区的种薯中是否存在PMTV。结果发现,11个品种130个种薯中,8个品种的39个薯块检出PMTV。2020年,超荷十五品种的PMTV检出率最高,为80%(4/5);2021年来源于内蒙古自治区的21个无明显PMTV症状的大白花种薯中有16个检出PMTV。在42个携带粉痂菌的种薯薯块中,有10个薯块检测到PMTV。(3)获得了2个PMTV中国分离物的全基因组序列并明确了与其他分离物的进化关系。通过RT-PCR获得PMTV中国分离物NMG1、NMG2的全基因组序列以及Shandong分离物的部分基因组序列。序列比对分析结果显示,PMTV编码的8个蛋白中,CRP的核苷酸一致率最低仅为87.7%、氨基酸一致率最低仅为77.9%。选择压力分析发现CRP基因为正选择(ω=1.59663),并鉴定到21个位点处于正选择。其余七个基因处于负选择,rep-2的选择压力最小(ω=0.1134)。基于RNA-TGB链和CRP基因构建系统进化树分析发现本研究获得的三个分离物属于同一分组,与中国云南、瑞典以及苏格兰分离物遗传距离较近。(4)成功构建了PMTV侵染性克隆并优化了接种方法。利用同源重组方法,分别将PMTV NMG1分离物RNA-rep、RNA-CP和RNA-TGB构建至双元载体p CB301-TRVRz,获得pPMTV-RNA-rep、pPMTV-RNA-CP和pPMTV-RNA-TGB。将分别含有三个不同基因组的载体的农杆菌菌液等比例混合后浸润本氏烟,能够成功侵染本氏烟,侵染效率为87.5%。同时明确将含有三个PMTV不同基因组载体的农杆菌菌液与含有p Bin-P19农杆菌菌液等比例混合后接种本氏烟,能够显著提高侵染效率,侵染效率达100%。
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