目的：在前期,本实验组人员已经完成乳牙龋高毒力株筛选及重组质粒载体pUChtrKO 的构建,本实验要将已筛选出的变形链球菌 HtrA 高毒力菌株复苏并在液体培养基 TPY 中增菌制备感受态刺激肽细胞[1],然后再向其中加入已经构建完成的重组质粒,通过基因的同源重组[2]来构建变形链球菌HtrA基因缺陷株。并使用细胞生物学、分子学等手段,对变形链球菌HtrA缺陷菌株进行进行细菌鉴定,确定为变形链球菌后再通过PCR扩增技术来鉴定以构建完成的细菌是否为变形链球菌HtrA缺陷株。最后将以构建完成的变形链球菌HtrA缺陷株和变形链球菌HtrA高毒力株经过增菌并系列稀释后,在红霉素的TSB平板上分别培养计数。通常以菌落数的多少,来评价变形链球菌HtrA基因缺陷菌株转化力的高低。从而来判断儿童口腔变形链球菌的致龋性是否受HtrA的调控,如果受它调控就可以为儿童龋病的防治找到新靶点[3] [4]。 方法：①构建变形链球菌高毒力株HtrA缺陷菌珠：已筛选出的变形链球菌HtrA 高毒力菌株常规复苏厌氧培养 48 小时,经鉴定为生长良好的变形链球菌菌落后在液体培养基TPY中增菌并制备出感受态刺激肽细胞,然后再向其中加入已经构建完成的重组质粒载体[5],通过基因的同源重组进行变形链球菌高毒力株HtrA基因缺陷株的构建。将已经转化的变形链球菌高毒力株经过倍比稀释后吸取120μl涂布在含红霉素的TSA-Eymr固体培养基平 板上,在温度37℃的条件下进行孵箱培养,大约需要24~48h,然后挑取菌落涂片、染色,在显微镜下观察细菌形态进行初步筛选。②变形链球菌高毒力株HtrA缺陷菌株的鉴定：根据HtrA的基因序列来设计HtrA基因的引物HtrF/HtrR并进行PCR扩增,再以红霉素抗性基因引物P1/P2, HtrA基因上游引物序列合并红霉素抗性基因引物HtrAUF/P1, HtrA基因下游引物序列合并红霉素抗性基因引物HtrAUR/P2进行PCR扩增,并将已经进行了 PCR 扩增的四个基因片段以含有 HtrA 基因的变形链球菌标准株基因组DNA为参照进行PCR鉴定[6]。③变形链球菌HtrA缺陷菌株转化力比较：将乳牙龋变形链球菌 HtrA 高毒力株和变形链球菌 HtrA 缺陷菌株分别在TPY 液体培养基中增菌, 在 37℃的水浴中培养 90min,经过系列稀释后吸取120μl菌液涂布于于含红霉素的TSA-Eymr固体培养基平板上, 37℃的条件下孵箱培养24-48h。经形态学鉴定确认为变形链球菌后行菌落计数来判断二者转化力是否有区别,可用5次试验结果的平均值来进行最终评估。 结果：将构建完成的变形链球菌HtrA基因缺陷菌株进行形态学和生化鉴定显示构建成功的细菌确实为变形链球菌,然后将由HtrA的基因序列来设计HtrA基因的引物HtrF/HtrR[7]、红霉素抗性基因引物P1/P2、HtrA基因上游引物序列合并红霉素抗性基因引物 HtrAUF/P1[8]、HtrA 基因下游引物序列合并红霉素抗性基因引物HtrAUR/P2分别进行PCR扩增,并与变形链球菌HtrA标准株基因组DNA进行对照鉴定[9]。并可使用凝胶自动成像分析仪对经过1%的琼脂糖凝胶电泳的DNA片段进行成像分析。其中1~4组为变形链球菌HtrA缺陷株组,5~8组为变形链球菌HtrA高毒力株组,以分子量为DL2100的变形链球菌HtrA标准株DNA作为Marker,图像显示第一组在DNA分子量为500bp处未出现特异性的电泳条带,而第五组在此处却 出现了一条较明亮的特异性条带,500bp为HtrA基因片段的DNA分子量。第二组在DNA分子量为710bp处出现一条明显的亮条带,而第六组在此处却未出现特异性条带,710bp 为红霉素抗性基因片段的 DNA 分子量[10]。第三、四组分别在DNA分子量为1200bp和1100bp处各出现一条明亮的条带。而第七、八组均未出现特异性条带,1200bp和1100bp又分别为HtrA基因上游引物序列合并红霉素抗性基因引物HtrAUF/P1和HtrA基因下游引物序列合并红霉素抗性基因引物HtrAUR/P2的DNA分子量。 变形链球菌HtrA高毒力株与变形链球菌HtrA基因缺陷菌株的转化力比较 结果：0~6 小时内,变形链球菌 HtrA 高毒力株和 HtrA 缺陷株都没有明显的生长,P>0.05,无统计学意义。 6~12小时内,变形链球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株都在逐渐增多,但增长的速度都不是很快,P<0.05,说明具有统计学意义。 12~24小时内,变形链球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株在明显的增长,增长速度较快,P<0.01,具有十分显著的统计学意义。 24~48小时内,变形链球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株再无没显著增长, P>0.05,无统计学意义。 但总体来讲,变形链球菌 HtrA 高毒力株的增长速度,要高于变形链球菌HtrA缺陷株,P>0.05,无统计学意义。 结论：通过基因重组等方法可以将变形链球菌HtrA高毒力株中的HtrA基因敲除,经过 PCR 鉴定与实验结果相符,从而成功构建变形链球菌 HtrA的缺陷株。变形链球菌HtrA高毒力株的转化力要明显高于HtrA缺陷株,从而可以证 实HtrA与变形链球菌的毒力有关,此结论可以为儿童龋病的防治找到新靶点[11]。