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研究背景瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬时感受器电位受体家族成员之一。该受体广泛分布在神经系统中,在外周神经系统TRPV4受体主要分布在感觉神经末梢,在中枢神经系TRPV4受体主要分布在海马、大脑皮层、丘脑、小脑等脑区。TRPV4受体是一种“多觉型”受体,可以被多种因素如细胞水肿、温热刺激、花生四烯酸及其代谢产物等激活,该受体激活后引起以钙离子为主的阳离子内流,导致细胞内游离钙离子浓度升高,并引起细胞膜去极化。资料报道TRPV4受体参与调节海马神经元细胞膜的静息膜电位水平。给予TRPV4受体激动剂可以增加视网膜节细胞自发放电频率,也可以增加三叉神经节神经元诱发动作电位的数目,提示激活TRPV4受体能增强细胞的兴奋性。但是激活TRPV4受体提高细胞兴奋性的机制尚不清楚。电压门控性钠通道(voltage-gated sodium channel,VGSC)是介导动作电位去极化过程的主要离子通道。根据对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感性的不同,VGSC可分为河豚毒素敏感型钠通道(TTX-sensitive sodium channel,TTX-S)和河豚毒素非敏感型钠通道(TTX-resistant sodium channel,TTX-R)两大类。对于神经元而言,TTX-S是介导动作电位去极化的主要离子通道。现已证实激活TRPV4受体可以调节外周伤害感受器细胞上的VGSC,然而在中枢神经系统尚无有关TRPV4受体调控VGSC的研究报道。神经元的兴奋性除了与细胞膜上离子通道的数目和功能状态有关外,还受兴奋性/抑制性神经递质系统功能的影响。谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质,本课题组前期研究发现激活TRPV4受体能增强谷氨酸受体的功能及兴奋性突触传递。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统内主要的抑制性神经递质,GABAA受体是介导GABA功能的主要离子型受体,阻断该受体可以提高神经元的兴奋性。蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2,PAR-2)的激动剂和热刺激均可激活TRPV4受体,研究表明分别给予上述两种刺激对GABA递质系统具有抑制作用,然而尚无有关TRPV4受体调节GABAA受体的直接证据。VGSC和GABAA受体的功能受到细胞内多条激酶信号通路磷酸化的调节。例如,激活蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)和蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)信号通路对VGSC具有抑制作用,并能抑制动作电位的产生。此外,p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)信号通路对神经元上的VGSC也有调节作用。GABAA受体上含有PKA、PKC、钙调蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)、磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)等激酶的磷酸化位点。本课题组前期的研究发现激活TRPV4受体可以通过调节PKA、PKC、CaMKⅡ等信号通路对三叉神经节神经元上的电压门控性钠、钾离子通道和海马神经元上的谷氨酸受体发挥调节作用。我们已发现激活TRPV4受体能增强p38 MAPK信号通路,抑制PI3K-Akt信号通路。基于上述报道和前期的研究,本课题提出激活TRPV4受体通过影响PKA、PKC、CaMKⅡ、PI3K等胞内信号通路调节VGSC和/或GABAA受体功能,为进一步阐明TRPV4受体调控神经元兴奋性的机制提供理论依据。研究目的1.明确激活TRPV4受体对海马神经元VGSC的作用及其机制。2.明确激活TRPV4受体对海马神经元GABAA受体的作用及其机制。第一部分 激活TRPV4受体对海马神经元VGSC的作用及其机制材料与方法1.全细胞膜片钳记录:制备海马冠状切片,记录海马CA1区锥体神经元电压门控性钠通道电流(voltage-gated sodium current,INa),观察 TRPV4 受体激动剂对INa的作用2.制备TRPV4受体激活的在体模型:侧脑室注射TRPV4受体激动剂,制备TRPV4受体激活的在体模型。3.蛋白印迹(Western blot):检测TRPV4受体激活后海马组织VGSC的α亚基(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6)和β1亚基蛋白水平的变化。结果1.给予TRPV4受体激动剂(GSK1016790A和4α-PDD)对海马CA1区锥体神经元的INa具有抑制作用,激活TRPV4受体能使INa的失活曲线向超极化方向移动,但对激活曲线无显著影响。2.给予TRPV4受体特异性阻断剂(HC-067047)或TTX-S钠通道阻断剂(TTX)能有效阻断GSK1016790A和4α-PDD对INa的抑制作用。3.给予PKA阻断剂能有效阻断GSK1016790A对INa的抑制作用,而给予PKC或p38 MAPK的阻断剂对GSK1016790A抑制INa的作用无显著影响。4.与对照组小鼠相比,GSK1016790A注射小鼠海马组织VGSC的Nav1.1、Nav 1.2和Nav 1.6亚基的蛋白水平显著升高,Nav 1.3和Nav β1亚基的蛋白水平无显著改变。结论急性激活TRPV4受体通过增强PKA信号通路抑制海马锥体神经元的INa,TRPV4受体激活后提高神经元兴奋性可能与此调节作用无关;慢性激活TRPV4受体能增加海马组织VGSC的α亚基蛋白水平,这可能是慢性长期激活TRPV4受体提高神经元兴奋性的机制之一。第二部分激活TRPV4受体对神经元GABAA受体的作用及其机制材料与方法1.全细胞膜片钳记录:制备海马冠状切片,记录海马CA1区锥体神经元GABA激活的电流(GABA-evoked current,IGABA),观察TRPV4受体激动剂对IGABA的作用。2.Western blot:用TRPV4受体激动剂GSK1016790A孵育海马脑片15分钟、30分钟、1小时和2小时,检测不同时间点海马组织腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)蛋白水平的变化。结果1.给予 TRPV4 受体激动剂(GSK1016790A,4α-PDD 和 5,6-EET)对海马 CA1区锥体神经元IGABA具有抑制作用。2.给予TRPV4受体特异性阻断剂(HC-067047)或GABAA受体阻断剂(荷包牡丹碱,bicuculline)能有效阻断TRPV4受体激动剂对IGABA的抑制作用。3.给予GSK1016790A能增加p-AMPK蛋白水平,降低p-Akt蛋白水平;去除细胞外钙离子或给予钙调蛋白激酶激酶-β(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-β,CaMKKβ)的阻断剂(STO-609)能有效抑制GSK1016790A的上述作用;给予AMPK阻断剂(Compound C)能有效抑制GSK1016790A降低p-Akt蛋白水平的作用。4.给予AMPK或PKC的阻断剂,或PI3K的激动剂能有效阻断GSK1016790A对IGABA的抑制作用,而给予PKA或CaMKⅡ的阻断剂则对GSK1016790A的作用无显著影响。结论激活TRPV4受体通过增强AMPK下调Akt信号通路,及通过增强PKC信号通路抑制iGABA,这可能是激活TRPV4受体增强神经元兴奋性的机制之一。