【摘 要】
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目的:为了研究atRAL引起感光细胞死亡的具体作用机制,并探究JNK信号通路在视网膜退化和感光细胞死亡中的作用。方法:首先,用atRAL处理感光细胞661W,分别用MTS法检测其细胞活力和TUNEL染色检测其细胞凋亡水平。通过蛋白免疫印迹检测细胞凋亡和DNA损伤相关的蛋白水平,并用免疫荧光的方法进行验证。其次,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测JNK信号通路的相关分子;同时,分别利用JNK特异性的抑制
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目的:为了研究atRAL引起感光细胞死亡的具体作用机制,并探究JNK信号通路在视网膜退化和感光细胞死亡中的作用。方法:首先,用atRAL处理感光细胞661W,分别用MTS法检测其细胞活力和TUNEL染色检测其细胞凋亡水平。通过蛋白免疫印迹检测细胞凋亡和DNA损伤相关的蛋白水平,并用免疫荧光的方法进行验证。其次,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测JNK信号通路的相关分子;同时,分别利用JNK特异性的抑制剂以及CRISPR-Cas9的技术获得Jnk1-/-Jnk2-/-661W进行进一步的分析。再次,利用流式细胞术和染色分析atRAL处理661W之后的活性氧的水平,并用抗氧化剂NAC进行预处理进一步分析ROS的产生、细胞活力以及免疫印迹检测其相关的蛋白水平。最后,利用光照诱导的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠的神经视网膜退化的动物模型进行验证,HE染色分析光照后WT和Abca4-/-Rdh8-/-小鼠视网膜的组织形态,并用TUNEL染色分析其细胞凋亡的水平,同时检测其凋亡和DNA损伤以及JNK信号通路相关蛋白水平;利用JNK特异性的抑制剂在动物模型中进行进一步的分析验证。结果:研究发现,在感光细胞中,atRAL诱导ROS的产生,导致JNK的激活进而损伤线粒体,使得线粒体Bak蛋白的水平升高,线粒体膜电位下降,细胞色素c（Cyt c）从线粒体释放至细胞质。细胞质中Cyt c特异激发caspase-9和caspase-3活化以启动细胞凋亡。另一方面,atRAL诱导感光细胞中JNK的磷酸化导致γH2AX的蛋白水平的升高,进而导致细胞的凋亡。对JNK信号的抑制可保护感光细胞免受atRAL引起的细胞凋亡和DNA损伤。此外,Jnk1Jnk2基因的敲除明显减轻了 atRAL诱导的感光细胞的凋亡和DNA损伤。而在光照诱导的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠的神经视网膜退化过程中发现JNK信号的激活。同时,腹腔注射JNK-IN-8可抑制光照后的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠中的JNK信号,缓解了视网膜的退化,减少了感光细胞的凋亡。结论:atRAL通过JNK信号介导的依赖于线粒体调控的caspase途径和DNA损伤途径引起感光细胞凋亡。JNK的激活介导了光照诱导的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠视网膜退化和感光细胞凋亡。抑制JNK信号的激活有效地缓解了光照诱导的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠视网膜退化和感光细胞凋亡。
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