论文部分内容阅读
鉴于高温已广泛用于诱导杨树大孢子、胚囊、合子以及花粉染色体加倍选育多倍体的育种实践。本研究围绕高温诱导杨树产生2n花粉的机制问题,以银灰杨(Populuscanescens)和银白杨(Populus alba)为研究材料,在优化高温处理诱导银灰杨产生2n花粉技术条件的基础上,综合细胞遗传学、分子遗传学以及多倍体诱导技术,系统地开展了高温处理对银灰杨花粉母细胞减数分裂染色体行为、微管骨架动态变化、减数分裂相关基因差异表达的影响研究,进而揭示高温诱导银灰杨产生2n花粉的细胞分子机制,为杨树三倍体育种奠定理论基础。主要研究结果如下: 1、明确了银灰杨花粉母细胞减数分裂与雄花芽/序外部形态、花药颜色变化的相关性。结果表明,银灰杨花药颜色变化可作为初步判别其花粉母细胞减数分裂时期的形态学标记,花粉母细胞从减数分裂细线期发育至四分体时期,花药颜色从嫩绿色,经由黄绿色、微红色、浅红色、鲜红色转为深红色;银灰杨同一花芽不同部位花粉母细胞的减数分裂进程存在明显的不同步性,花芽顶部花粉母发育最快,基部次之,中部发育最慢。 2、优化了高温诱导银灰杨产生2n花粉的技术条件,首次获得起源于花粉染色体加倍的银灰杨三倍体42株。研究发现,始处理时期以及持续处理时间对银灰杨2n花粉诱导率影响极显著,处理温度影响不显著。当花粉母细胞发育至双线期至终变期时,利用38℃或41℃的高温,持续处理6h,最高可获得58.03%的2n花粉。与对照花粉相比,高温处理花粉表面结构未发生明显变化。利用高比率的2n花粉与银白杨单倍性雌配子杂交,获得杂种子代911株,其中三倍体42株,三倍体得率最高可达10.71%,说明高温处理未对花粉活力造成显著影响。 3、高温处理可导致银灰杨花粉母细胞第二次减数分裂缺失,大量形成二分体。在对照组中,花粉母细胞减数分裂未观察到任何异常现象。四分体时期可观察到2.80%的二分体、1.57%的三分体、95.45%的四分体以及0.18%的多分体。经38℃高温持续处理6h后,大部分花粉母细胞经历第一次减数分裂后,直接进入细胞质分裂,形成大量的二分体。四分体时期可观察到53.24%的二分体、3.42%的三分体、42.80%的四分体以及0.54%的多分体。 4、高温处理可诱导银灰杨花粉母细胞着丝粒微管解聚和成膜体微管的形成。当银灰杨花粉母细胞进入双线期-终变期时,利用38℃高温持续处理6h后,花粉母细胞减数分裂自前期Ⅰ至中期Ⅰ的微管骨架与对照组相似,未发现明显变化。后期Ⅰ时,随着同源染色体的分开,着丝粒微管解聚,观察不到聚合成束的着丝粒微管。进入末期Ⅰ后,花粉母细胞不再进行第二次减数分裂,而是直接进行细胞质分裂,在细胞板位置形成明显的喇叭状成膜体微管,调控细胞质分裂。 5、实现了银灰杨三倍体2n配子来源的SSR分子标记鉴定,证实高温处理主要导致SDR型2n配子的产生。从185对重组率低、多态性好的SSR引物中,筛选出31对引物,对42株三倍体进行分析,证明其中38株源自SDR型2n配子,4株源自FDR型2n配子,分别占三倍体植株的比例为90.5%和9.5%,说明高温处理主要导致SDR型2n花粉产生。 6、表达谱分析结果推测高温诱导银灰杨细胞周期蛋白A基因CCNA下调表达可导致第二次减数分裂缺失,形成2n花粉。通过对38℃高温持续处理3h和6h的雄花芽进行表达谱测序分析,共检测到41573个基因。与对照组相比,38℃高温持续处理3h和6h可分别检测到1971和3553个差异表达基因,其中与细胞周期相关的差异表达基因分别为10个和22个。与38℃高温持续处理3h的实验组相比,38℃高温持续处理6h可检测到918个差异表达基因,其中与细胞周期相关的差异表达基因8个。通过对细胞周期差异表达基因进行功能注释发现,细胞周期蛋白A基因CCNA下调表达可导致减数分裂第二次缺失,产生二分体,进而形成2n花粉。 综上所述,经高温处理后,银灰杨花粉母细胞减数分裂Ⅱ缺失,导致大量二分体的形成,进而发育形成2n花粉,是高温处理诱导银灰杨产生2n花粉的细胞学机制;高温处理可诱导细胞周期蛋白A基因CCNA下调表达,致使花粉母细胞第二次减数分裂缺失,推测高温诱导细胞周期蛋白A基因CCNA下调表达可能是高温处理诱导银灰杨产生2n花粉的分子机制。