ASR(ABA,stress,ripening induced protein)基因是一类亲水性小分子量的植物特异性蛋白,在番茄、烟草、木瓜、马铃薯、玉米、蜜柚、火炬松、百合花、水稻、葡萄和草莓等物种中都发现了该基因家族的存在。ASR基因在不同的细胞类型中被发现定位在细胞核,可作为转录因子结合特异的DNA序列来调控基因的表达。ASR基因与生物及非生物胁迫有着非常紧密的联系,在糖和ABA信号的转导中发挥着重要作用。本实验室前期从香蕉果实(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)的cDNA文库中获得了一个ASR基因(MaASR1,登录号为AY628102),并且得到了MaASR1基因的拟南芥转基因株系L14,对其的初步研究发现MaASR1基因在拟南芥中的过量表达显著提高了拟南芥的抗旱能力。为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制,运用芯片技术(DNA microarray)来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。为了进一步得到MaASR1作为转录因子发挥调控作用与之结合的直接靶基因,利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)来进行更深入的研究。然后对表达谱芯片和ChIP-SEQ得到的结果进行生物信息学分析及RT-PCR验证。之后构建载体利用原核表达技术表达出MaASR1蛋白,对其纯化后,利用EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术对于MaASR1蛋白直接相互作用的基因元件进行体外验证,得到与MaASR1蛋白结合的特异DNA序列。主要研究结果如下：1)未经任何处理的野生型和转基因型拟南芥的表达谱芯片(14vs WT)中,一共得到747个差异基因,其中上调基因559个,下调基因188个；经干旱处理的野生型和转基因型拟南芥的表达谱芯片(Y vs W)中,一共得到653个差异基因,其中上调基因256个,下调基因397个。2)对表达谱芯片得到的差异基因按照参与的生物过程,定位及其所具有的生物学功能进行分类。按照参与的生物过程分类时,参与光合作用和蛋白修饰的差异基因变化最显著；按照定位分类,定位在质体的差异基因变化最显著；按照其所具有的生物学功能进行分类,具有转运活性、催化活性和蛋白结合活性的基因变化最明显。3)对基因芯片中得到的与激素(ABA,乙烯和生长素)相关基因进行RT-PCR验证。结果表明：①在未做任何处理和干旱胁迫条件下,MaASR1转基因拟南芥与野生型相比ABA的生物合成量降低,降解量升高。干旱胁迫时,MaASR1的转入可以提高ABI5和ABF1的表达量,ABI5通过调控部分LEA类蛋白的表达和增强ABA诱导基因的表达来赋予拟南芥转基因植株耐早性和抗旱性。ABFl可以通过与其它ABI基因协同作用和参与ABA信号途径来赋予拟南芥转基因植株抗旱性。MaASR1转基因株系抗旱性的获得,不通过CBL/CIPK复合物参与的依赖ABA途径和不依赖ABA途径的方式来完成胁迫应答。②在干旱胁迫条件下,MaASR1的转入通过提高ACS6和ACO1的表达水平提高了拟南芥体内的乙烯合成水平。MaASR1的转入可以通过正调控乙烯反应和提高ERF类基因的表达来赋予植物抗旱性。③MaASR1的转入不通过提高GH3.3和GH3.5表达量来赋予转基因植物抗旱性。可以通过提高了HAT2的表达水平来降低植物体内IAA含量,从而增强植物的抗旱性。MaASR1的转入改变了部分生长素应答基因的在干旱胁迫下的调控模式。4) MaASRl可以提高不依赖ABA途径的DREB2A的表达量,推测其可能通过调控不依赖ABA信号通路的胁迫信号转导途径来调控植物的抗旱应答,进而赋予植物抗旱能力。5)基因芯片和ChIP-SEQ的结果都表明,干旱胁迫条件下MaASRl的转入通过影响光系统Ⅰ、光系统Ⅱ、叶绿体和RUBISCO活化酶等相关基因的表达来影响光合作用造成转基因型光合速率的降低,从而降低蒸腾作用以保留水分,在一定程度上提高了植物的抗旱性。6)14vs WT基因芯片结果表明,C3HC4型锌指蛋白基因是网络连接度最高的基因之一,香蕉MaASR1基因的转入大大提高了C3HC4型锌指蛋白基因的表达水平。说明其可以通过调控C3HC4型锌指蛋白基因的表达水平来赋予植物较强的耐旱能力。7) Y vs W基因芯片结果表明,糖转运蛋白家族基因是网络连接度最高的基因之一,表明了干旱胁迫条件下糖转运家族蛋白在整个代谢网络中的重要地位,以及在干旱胁迫条件下ASR与糖转运家族蛋白的密切关系。8)以拟南芥幼苗为材料进行染色质免疫共沉淀(ChIP)超声波破碎条件的摸索,得到适用于拟南芥幼苗的最佳ChIP试验条件以用于后续的试验。为得到更多的DNA与蛋白质相互作用的信息提供了条件,也为染色质免疫共沉淀技术的应用奠定了基础。9)针对香蕉MaASRl基因,构建原核表达载体pET30a-MaASRl进行原核表达,对目的条带用Ni-Agarose亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE和Western验证即为重组蛋白。为后续通过EMSA进行体外MaASRl蛋白与特异DNA元件的验证奠定基础。10)基因芯片和ChIP-SEQ结果都表明,干旱胁迫条件下,MaASR1的转入使糖转运家族蛋白发挥着重要作用。EMSA结果证明MaASRl与己糖转运蛋白有直接的相互作用,MaASR1可以通过与己糖转运蛋白启动子特定序列结合来调控己糖转运蛋白的表达,进而调控己糖的代谢。而己糖可以通过调节细胞渗透势的变化有效地保护细胞膜和蛋白质的结构,防止细胞因失水而造成细胞内养分的损失和细胞的损伤,从而使转基因拟南芥具有较强的抗旱能力。11) ChIP-SEQ结果及RT-PCR和EMSA验证结果都表明,MaASR1可以与小G蛋白亚家族成员RhoGAP启动子区序列结合,香蕉MaASR1通过调控小G蛋白RhoGAP的表达来负调控拟南芥“分子开关"RopGTPase的表达,使RopGTPase处于非活化的状态,从而间接参与ABA信号传导通路来响应干旱胁迫。