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脊椎动物拥有现存生物中最为复杂的中枢神经系统,揭示其如何起源是进化发育生物学领域研究的重要命题之一。在脊椎动物胚胎发育中,Sonic Hedgehog（Shh）信号对于其中枢神经系统神经管背腹图式的正确建立起着关键作用。Shh（Shh信号的配体）表达于脊索和神经管底板,并在神经管腹部到背部区域呈梯度分布。受该梯度及其引起的Shh信号活性差异影响,Nkx6.1、Nkx2.2、Olig2、Pox6、Irx3、Pax3和Pax7等转录因子分别表达于神经管背腹不同区域,并通过它们相互间的抑制作用诱导不同类型神经元在各自调控区域内分化。文昌鱼（Amphioxus）隶属于头索动物,其进化地位介于脊椎动物和无脊椎动物之间,存在与脊椎动物相似的背神经管结构,并且在文昌鱼胚胎中,Hh基因及Nkx6、OligA、Pax4/6、Irx和Pax3/7等基因的表达模式也与脊椎动物同源基因类似,所以,文昌鱼是研究脊椎动物神经管图式形成机制起源的良好模型。本研究首先以文昌鱼Hh信号成员Hh（配体）和Ptch（受体）基因突变体胚胎为实验材料,分析Hh信号在文昌鱼神经管背腹图式形成中的功能。在此基础上,论文进而对文昌鱼神经管腹部运动神经元（受Hh信号调控）的形成机制开展了深入分析。具体实验结果如下:1、在文昌鱼Hh-/-突变体胚胎中,Hh信号消失,神经管腹侧标记（marker）基因Netrin、Nkx6和OligA基因表达量降低、Nkx2.2表达量不变,中间区域标记基因Pax4/6、IrxA、IrxB和IrxC表达无明显变化,背侧标记基因Dlx表达也无明显变化,而Pax3/7基因在晚期神经胚脑泡中的表达量升高。与Hh突变体相反,在Ptch-/-突变体胚胎中,Hh信号活性升高,神经管腹侧基因Netrin和OligA表达区域扩大,背侧基因Pax3/7的表达降低,但其他基因的表达量均未检测到明显变化。这些结果说明,Hh信号只参与文昌鱼神经管腹侧区域发育,而对神经管中间区域和背侧区域发育几乎没有作用（脑泡背部Pax3/7表达区域除外）。2、脊椎动物运动神经元位于神经管腹侧区域,其分化形成受Nkx6.1、Olig2、Mnr2、Lim3和Islet1等基因调控。Nkx6和OligA在文昌鱼Hh-/-突变体中的表达消失暗示,Hh信号可能同样参与了文昌鱼运动神经元的发生。与该假设相符,文昌鱼Mnxa、Lhx3和Islet（Mnr2、Lim3和Islet1同源基因）在Hh-/-突变体中的表达区域也出现了消失或缩小。进一步的原位杂交分析显示,Nkx6和OligA是上述基因中最早受Hh信号活性影响的基因,然后依次是Mnxa、Lhx3和Islet。并且在位于第Ⅰ和第Ⅳ体节之间神经管处,Nkx6、OligA和Mnxa的表达位置重叠,且与Lhx3和Islet的表达位置基本一致。上述结果暗示,Nkx6、OligA、Mnxa、Lhx3和Islet等基因及其构成的网络在文昌鱼神经管腹侧运动神经元分化中具有重要作用。3、文昌鱼运动神经元由三种类型构成,分别为DC运动神经元（dorsal compartment motor neurons,DC MN）、VC 运动神经元（ventral compartment motor neurons,VC MN）和内脏运动神经元（visceral motor neurons,vMN）。此前研究认为,Err在DC MN中特异表达,而Vacht（乙酰胆碱转运蛋白编码基因）在三种运动神经元中均有表达。我们发现,在Hh-/-突变体中,Vacht和Err阳性细胞的数目均减少,而在Ptch-/-突变体中,仅Err阳性细胞的数目增加。然而进一步的分析却显示,在正常胚胎中,Vacht和Err的表达位置并不重叠,并且在Err-/-突变体中Vacht的表达未发生明显变化。以上结果说明,1)Hh信号只参与了部分MN形成的调控,2)Err阳性细胞不是运动神经元,因而更不是DC MN,3)但部分Err阳性细胞的分化同样受Hh信号的调控。4、为了进一步阐明Nkx6、OligA、Mnxa、Lhx3和Islet在文昌鱼MN分化中的调控关系,我们分别对Nkx6、OligA、Mnxa基因进行敲除过表达分析。结果显示,在Nkx6-/-突变体胚胎中,Nkx6表达消失,而OligA、Mnxa、Lhx3和Islet等基因表达未发生明显变化;在OligA-/-突变体胚胎中,OligA及其他上述基因表达均未发生明显变化;在Mnxa-/-突变体胚胎神经管中,Mnxa表达消失,Nkx6和OligA阳性细胞数目不变,Lhx3、Islet和Vacht阳性细胞数目减少,Err阳性细胞数目增加;Nkx6和OligA单独或共同过表达对Mnxa基因表达无明显影响;Mnxa过表达对Lhx3无显著影响,但却可导致Err阳性细胞数目明显减少。上述结果暗示,1)在文昌鱼MN发育调控中,Mnxa基因可能位于Nkx6和OligA下游,Lhx3和Islet上游;2)Nkx6和OligA层面存在代偿通路,这与文昌鱼存在多个Olig基因且表达模式相似的结果相符;3)Mnxa对Err阳性细胞形成具有抑制作用。以上所有结果表明,尽管Hh基因在文昌鱼和脊椎动物胚胎中的表达模式相似（均表达于腹侧神经管和脊索）,但Hh信号在这两类群物种神经管背腹图式（patterning）形成中的功能却存在明显差别:在文昌鱼胚胎中,Hh只参与神经管腹侧部分MN和Err阳性神经元发育调控,而在脊椎动物胚胎中,Shh参与整个神经管背腹图式的形成。此外,与脊椎动物不同,在文昌鱼胚胎中,表达于神经管背腹不同区域的转录因子间缺乏明显的相互抑制作用（除Mnxa对Err有抑制作用外）。我们推测,上述差异可能是导致脊椎动物中枢神经系统高度复杂化的主要原因。