斑马鱼（zebrafish，Danio rerio）核糖核酸酶A超家族（RNase A superfamily）由Elio Pizzo等于2006年首次发现。迄今为止已报道的成员一共有5名，分别被命名为zebrafish RNase1/2/3/4/5(ZF-RNase-1/2/3/4/5)。作为人类血管生成素(humanangiogenin，hANG)的同源基因，它们与hANG在蛋白质晶体结构和细胞水平功能学方面有相当高的相似程度。考虑到小鼠体内存在6个hANG同源基因和3个假基因，进行hANG功能学研究较为复杂，我们拟用斑马鱼作为体内功能研究的动物模型。为此，本文在初略探明斑马鱼胚胎发育早期ZF-RNases表达情况的基础上，对2个在该时期显著表达的成员----ZF-RNase-1和5进行了深入研究，不仅构建了两者的时空表达模式，还探索了它们在该时期的体内生物学功能。本研究主要内容包括：　　⑴从AB品系野生型斑马鱼整胚的cDNA中克隆得到ZF-RNases的表达序列(expressed sequence tags，ESTs)，利用半定量PCR(semi-quantitative reversetranscription and PCR，semi-quantitative RT-PCR)的方法明确了5名成员中仅ZF-RNase-1/3/5在斑马鱼胚胎发育早期显著表达。在此基础上，我们利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR，qRT-PCR)技术研究了ZF-RNase-1/3/5在受精后0-72小时的时间表达谱。结果显示，ZF-RNase-1在该时期的表达丰度极低，仅在受精后24小时被特异性上调;ZF-RNase-3/5在该时期的表达水平随时间逐渐上升，提示ZF-RNase-1/3/5在斑马鱼胚胎发育早期可能扮演不同角色，且ZF-RNase-1很可能仅参与调控受精后24小时这一时间点的特定发育学过程。鉴于已报道的ZF-RNase-3在蛋白质晶体结构和体外功能方面与hANG差异比较明显，而在我们的初步探索中亦未发现其明显的体内功能（详见讨论6.1），我们将研究重点集中到ZF-RNase-1和5上。　　⑵原位杂交（in situ hybridization）结果显示，ZF-RNase-1 mRNA主要分布于原初脑和躯干腹侧;ZF-RNase-5 mRNA除了分布于以上组织区域外，还分布于卵黄囊四周。已知在斑马鱼胚胎发育早期，躯干腹侧是主要血管——背主动脉(dorsalaorta，DA)和后主静脉(posterior cardinal vein，PCV)所在的位置。因此，我们的结果明显提示这两个ANG同源基因可能参与对斑马鱼血管系统发育的调控，而ZF-RNase-5还可能与卵黄组织的形成或功能息息相关。为深入研究其功能，我们利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术获得了ZF-RNase-1/5的全长cDNA。测序结果显示，相比于NCBI数据库中的对应序列，本论文得到的ZF-RNase-1的cDNA缺失了整段信号肽序列，而ZF-RNase-5 cDNA的5UTR不仅在-1至-104位的序列一致性仅为46％，还在-104位之前多出约170个碱基，提示虽然ZF-RNase-1被归为斑马鱼核糖核酸酶A超家族，但它可能并非作为传统认为的分泌蛋白来发挥作用。　　⑶利用能在斑马鱼胚胎中特异性下调特定基因表达的常用工具——Morpholinos(Morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides, MOs)下调ZF-RNase-1/5的表达水平，期望通过对表达下调后的胚胎所表现出的缺陷表型研究，初步揭示它们在胚胎发育早期的不同阶段、不同组织中所行使的功能。　　⑷利用可实时观察和研究斑马鱼血管新生的转基因斑马鱼品系Tg(fli1∶EGFP)y1来探索ZF-RNase-1在胚胎发育早期血管新生中的功能。我们将特异性靶向ZF-RNase-1的MOs注射入该转基因斑马鱼的单细胞期受精卵的卵黄中，观察并记录受精后2天以内的血管新生情况。结果显示，ZF-RNase-1的MOs导致胚胎在受精后36小时表现显著的体节间血管(intersegmental vessel，ISV)缺陷，即ISV未延伸至背侧顶端并形成背侧纵向吻合血管(dorsal longitudinal anastomoticvessel， DLAV);该表型能够通过补入体外转录的ZF-RNase-1 mRNA部分挽救。当我们仅注射ZF-RNase-1 mRNA进行过表达时，胚胎表现出显著的ISV异位生长现象，即ISV延伸至水平肌隔之上、尚未至背侧顶端即提前分支，但最终却在背侧顶端形成正常的DLAV。进一步研究表明，ZF-RNase-1表达水平的改变导致了促血管新生的VEGF信号在血管内皮细胞膜表面的受体分子----kdrl(kinase insertdomain receptor like，VEGFR2)表达水平的相应变化，而对抑制血管异位生长的Notch信号的配体分子----delta like ligand4(dll4)的表达水平无显著影响。以上结果表明，ZF-RNase-1通过VEGF信号通路促进了胚胎发育早期血管新生过程中ISV的生长。　　⑸研究了ZF-RNase-5在胚胎发育早期血管新生及其卵黄延伸体形成和形态维持上的作用。在Tg(fli1∶EGFP)y1转基因斑马鱼中下调ZF-RNase-5的表达后，胚胎发育早期血管新生中的ISV萌芽受到抑制;该表型能够通过补入体外转录的ZF-RNase-5 mRNA显著挽救。此外，这些胚胎还表现出显著的形态学特征----卵黄延伸体的缺陷。卵黄延伸体是从胚胎靠近头部的球形卵黄囊向尾部延伸而形成的圆柱形腹侧组织，主要为发育早期的胚胎躯干部提供营养物质。为更直接地研究上述卵黄延伸体的缺陷表型，我们将特异性靶向ZF-RNase-5的MOs注射入AB品系野生型斑马鱼单细胞期受精卵的卵黄中，导致在受精后2-5天胚胎的孵化率和存活率显著降低，提示ZF-RNase-5对早期胚胎发育是重要和必要的。在受精后24小时，这些胚胎依然表现出严重的卵黄延伸体缺陷，即卵黄延伸体显著缩小甚至完全缺失;该表型亦能够通过补入体外转录的ZF-RNase-5 mRNA部分挽救。进一步，我们通过TUNEL实验发现下调ZF-RNase-5的表达诱导了胚胎卵黄合胞体层中特异性的DNA损伤。以上结果提示，ZF-RNase-5在卵黄延伸体的形成、维持及躯干间的营养物质运输和代谢扮演了关键性的角色。在检测到抑制ZF-RNase-5的表达显著上调胚胎体内与DNA损伤及细胞凋亡密切相关的p53蛋白水平并激活下游基因p21和Bax表达的基础上，我们利用p53基因操作和tp53基因DNA结合域突变的转基因斑马鱼tp53M214K进行机制研究。结果显示，当共注射特异性靶向ZF-RNase-5和p53的MOs后，上述卵黄延伸体的缺陷被显著地部分挽救;抑制tp53M214K中ZF-RNase-5的表达未引起上述卵黄延伸体的缺陷。以上结果表明，下调ZF-RNase-5的表达不仅抑制了胚胎发育早期血管新生中ISV的萌芽，而且显著上调了p53的蛋白水平，激活了p53信号通路，诱导了该时期卵黄合胞体层中特异性的DNA损伤，从而引起了严重的卵黄延伸体缺陷。　　⑹在人类胎盘发育过程中hANG不仅在蜕膜期的腺上皮细胞、母源血管细胞、巨噬细胞中显著表达，还可由绒毛外滋养层细胞、绒毛滋养层(extravillous and villous cytotrophoblasts)细胞分泌。本论文结果证明ZF-RNase-5在卵黄组织（亦被称为假胎盘，与人类胎盘的主要功能相似）中高表达并发挥了积极作用。因此，我们有理由推测hANG可能参与调控了人类胎盘正常形态或功能的维持。　　⑺本研究不仅构建了hANG的同源基因----斑马鱼核糖核酸酶A超家族成员ZF-RNase-1和ZF-RNase-5在胚胎发育早期的时空表达谱，完成了其cDNA全长的测定，还初步揭示了它们在该时期的体内生物学功能。其中，ZF-RNase-1通过VEGF信号通路促进了血管新生中ISV的生长;ZF-RNase-5不仅与血管新生中的ISV萌芽相关，而且通过p53信号通路调控卵黄延伸体形态的维持。我们的研究结果表明，hANG在体内的生物学功能与血管新生和胚胎发育相关。