目前,临床上使用的抗癌药物包含许多种,其中治疗乳腺癌的化疗药物主要有紫杉醇和环磷酰胺等。在临床治疗中,化疗药物的应用获得了较好的疗效,但化疗药物同时也是一把双刃剑,同时也给病人带来较大副作用,例如引起了人体的免疫系统、消化道、造血系统、皮肤和粘膜、神经系统、肝功能、心脏、肺毒性、肾功能及其他等伤害,有时还可出现并发症,常见的有感染、出血、穿孔、尿酸结晶等。如何能够在维持甚至提高患者疗效的同时,降低给患者带来的一系列副作用,一直在困扰着临床医生。虽然,已经有乳腺超声、钼靶、核磁等方法被应用于乳腺癌临床中。但是,依然不能满足临床的需求。人们还是应用注射亚甲蓝染料、纳米碳、核素等追踪前哨淋巴结方法去开展一些研究与探讨。萤火虫荧光素酶标记癌细胞在体内成像的方法,可构建稳定表达荧光素酶的细胞系和可视化动物模型。与其它方法相比,此种方法生物学特性稳定,毒性较小,克服了检测时高强的背景噪音,其波长的优势使所发出的光更容易透过组织,萤光信号强,可在短时间内表现出更强的应答等优点。但是,还需要探讨该方法在增加灵敏度的同时,是否会干扰药物抗癌作用等问题进行更深入的研究。作为肿瘤基因治疗,溶瘤病毒疗法已成为治疗癌症的重要手段之一。本课题组在先前的研究中构建了双重特异性抗肿瘤重组腺病毒,将其命名为Ad-apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)。即,在原有腺病毒中插入肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)和特异性抑癌基因(apoptin),由肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)启动E1A基因(病毒复制必需基因)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子启动凋亡素基因(Apoptin),因此,Ad-VT是一种具有同时在肿瘤细胞中特异性复制和特异性抑制的对正常细胞毒副作用小的溶瘤腺病毒。现如今乳腺癌患者患病率位居女性癌症首位,而且临床综合治疗给女性患者的身心带来很大伤害。各种有效的副作用小的治疗方法不断出现,将给癌症治疗带来曙光。因此,本研究旨在探讨乳腺癌可视化模型构建及重组腺病毒Ad-apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)与紫杉醇(PTX)联合应用对乳腺癌协同抑制作用,力争为乳腺癌患者带来新的获益。新的治疗方法也有望成为临床中尚未解决难题的希望。方法:1、用pGL4.51质粒转染MDA-MB-231细胞,以构建稳定表达荧光素酶(MDA-MB-231-LUC)的肿瘤细胞,使Ad-VT与紫杉醇(PTX)联合治疗乳腺癌可视化。2、使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇(PTX)的协同作用,并确定最终的药物浓度。3、结晶紫染色和WST-1实验用于分析Ad-VT和紫杉醇联合对MCF-7,MDA-MB-231和MCF-10A细胞的抑制作用。4、使用Hoechst,Annexin V,JC-1染色和ROS检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。5、使用caspase酶活性检测和caspase3、PARP以及细胞色素c蛋白水平检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。6、使用划痕、Transwell迁移和侵袭实验分析检测了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的抑制作用。7、使用MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测,分析了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞转移的抑制作用。8、通过建立荷瘤裸鼠模型和转移瘤模型来证实Ad-VT和紫杉醇的组合对体内肿瘤的抑制作用。结果:1、不同毒价Ad-VT与不同浓度化疗药物交叉联合,在WST-1实验中所得到的抑制率结果数据引入calcusyn软件,可以得出结论:部分范围数据的CI指数小于1。2、结晶紫染色结果提示Ad-VT可以在MCF-7和MDA-MB-231细胞中引起明显的细胞毒性,但对MCF-10A细胞基本无毒。紫杉醇对MCF-10A细胞具有一定的细胞毒性作用,当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,在提高对乳腺癌细胞杀伤作用的同时会降低对正常细胞的毒性。在WST-1实验结果中,我们还发现Ad-VT对两种乳腺癌细胞都有明显的抑制作用,抑制率可以达到40%左右,并且对正常的乳腺上皮细胞没有毒性作用,而紫杉醇具有明显的细胞毒性。在正常的乳腺上皮细胞上(P<0.01)。当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,对正常细胞的杀伤显著低于对癌细胞的杀伤作用(P<0.05),并且联合治疗后对乳腺癌细胞的抑制作用也明显高于单独使用Ad-VT或紫杉醇的抑制作用(P<0.05),联合时抑制率高于65%。3、在Hoechst染色结果中,Ad-VT和紫杉醇联合使用后,细胞凋亡比例明显高于Ad-VT组和紫杉醇组;在Annexin V结果中,我们还发现Ad-VT和紫杉醇联合使用后,两种类型的乳腺癌细胞的凋亡水平显著增加,达到约75%(p<0.05)。通过JC-1染色发现,Ad-VT联合紫杉醇组对两种乳腺癌细胞的线粒体膜电位变化更为显著。在红绿荧光比值结果中,我们还发现,Ad-VT组的线粒体膜电位明显低于对照组和紫杉醇治疗组(p<0.01),合并后这种现象更为明显。ROS检测结果表明,Ad-VT在乳腺癌细胞中会使活性氧水平升高,与紫杉醇联合使用后效果更加显著。4、Caspase活性检测和凋亡相关蛋白检测中发现,Ad-VT会使凋亡蛋白水平显著提升,与紫杉醇联合使用后这种现象更为明显。5、在划痕和Transwell迁移试验中,发现Ad-VT,紫杉醇和联合疗法可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移能力。Ad-VT的疗效显著高于紫杉醇,联合治疗后的疗效显著高于Ad-VT组和紫杉醇组(p<0.01)。在侵袭检测中也观察到了相似的结果。6、MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测后发现,Ad-VT和Ad-VT与紫杉醇联合使用后均能使MMP2、MMP9、Vimentin和Snail蛋白水平降低,并提高E-cadherin蛋白水平。7、使用活体成像系统观察肿瘤的生物发光强度变化,并连续观察6周。在4-6周时,1×10~9 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×10~9 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组的平均生物发光强度为显著低于对照组(P<0.05)。Ad-VT联合紫杉醇的抑制作用明显高于单独的病毒或药物。在小鼠存活率结果显示,联合后,小鼠的存活率显著延长,平均存活时间为1×10~9PFU/100μl Ad-VT+20mg/kg紫杉醇治疗组和1×10~9 PFU/100μl Ad-VT+10mg/kg紫杉醇治疗组,分别为40.2d和39.6d。42天时,两只治疗组小鼠的存活率分别为80%和70%。8、使用活体成像系统观察转移瘤模型后发现,除了1×10~9 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×10~9 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组以外,在其余治疗组和对照组的肺部中可以明显的看出肿瘤转移的现象。结论:1.成功构建了表达荧光素酶的人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC,使双特异性重组溶瘤腺病毒Ad-VT与紫杉醇联合在乳腺癌裸鼠体内治疗中疗效可视化。2.使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇(PTX)联合应用具有协同作用,并确定最终的药物浓度为50 MOI Ad-VT+4 nmol紫杉醇。对正常乳腺上皮细胞的毒副作用较小。3.Ad-VT和紫杉醇联合应用可以显著增加对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制。通过线粒体途径诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。4.Ad-VT和紫杉醇联合应用可抑制体内肿瘤生长和转移。而应用荧光素酶标记人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC在体内抑制实验中,未见明显的毒副作用。综上所述,重组腺病毒Ad-VT具有特异性复制和特异性抑癌的特性,可以抑制乳腺癌细胞的生长并促进其凋亡。同时,与紫杉醇联合使用具有协同作用,并起到减毒增效的作用。并且对三阴性乳腺癌细胞的杀伤与激素依赖型乳腺癌细胞抑制作用基本一致。这将为乳腺癌患者在增高疗效的同时减少毒副作用,为乳腺癌的综合治疗提供了新的线索。