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青娥丸首载于宋·《太平惠民和剂局方》,由杜仲(盐炒)、补骨脂(盐炒)、核桃仁(炒)、大蒜(蒸熟)四味药组成,具有补肾强腰的功效,用于肾虚腰痛,起坐不利,膝软乏力等症。临床上用于治疗骨质疏松、黄褐斑、更年期心脏病等。但到目前为止,青娥丸组方药味的药效物质基础并不明确,国家标准仅有性状和显微鉴别项。本文对青娥丸的组方药味开展了化学成分研究,建立了内源性雌激素及单胺类神经递质的测定方法并用于青娥方的活性评价,在此基础上制订了青娥丸的质量标准。本研究可为青娥丸的临床用药安全和质量控制提供科学依据,也可为其它中药复方的质量标准研究提供借鉴。
一、青娥丸组方药味的化学成分研究
采用多种现代分离技术和方法,对青娥丸中的君药杜仲、臣药补骨脂、佐药核桃仁分别进行了化学成分研究。
从杜仲中共分离鉴定出3个化合物,分别为松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、栀子苷。
从补骨脂中共分离鉴定出27个化合物,其中香豆素类化合物6个:异补骨脂素、补骨脂、补骨脂定、bavacoumestan C、1",2"-去氢异补骨脂定、双羟基异补骨脂定;黄酮类化合物14个:补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂二氢黄酮,异黄酮类包括补骨脂异黄酮、corylifols A、新补骨脂异黄酮、大豆苷、染料木苷、补骨脂醇、异补骨脂查尔酮、4-hydroxylonchocarpin、补骨脂查尔酮、补骨脂色烯素、brodimacutin G、黄芪苷;苯并呋喃糖苷类3个:psoralenoside、isopsoralenoside、psoralic acid O-β-D-glucopyranoside:杂萜类:补骨脂酚;其他类:腺苷、β-谷甾醇、胡萝卜苷。其中bavacoumestan C为新化合物,1",2"-去氢异补骨脂定为新天然产物,染料木苷、brodimacutin G、psoralic acid O-β-D-glucopyranoside、腺苷4个化合物为首次从补骨脂中分离得到。
从核桃仁中分离鉴定出7个具有DPPH自由基清除活性的化合物,分别为连苯三酚、对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸乙酯、原儿茶酸、没食子酸和3,4,8,9,10-五羟基二苯并[b,d]吡喃-6-酮,7个化合物均为首次从核桃仁中分离得到,其中连苯三酚、没食子酸乙酯、3,4,8,9,10-五羟基二苯并[b,d]吡喃-6-酮为首次从胡桃属中分离得到。
二、基于超高效液相色谱-质谱联用技术的内源性甾体激素和单胺类神经递质定量分析方法的建立及其在青娥丸药效评价中的应用
围绝经期综合征以雌激素水平急剧下降为起因,伴随一系列的与神经内分泌功能相关的症状,如潮热、抑郁、失眠、记忆力衰退等。为探讨青娥丸对雌激素水平以及神经内分泌功能的影响,采用超高效液相-质谱联用技术建立了内源性甾体激素以及单胺类神经递质的定量分析方法。
采用柱前衍生化-UPLC/MS/MS法建立了内源性甾体激素,包括雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、雌酮(E1)、孕酮(P)、睾酮(T)的测定方法。对志愿者血清样本的雌二醇、孕酮(P)、睾酮(T)的含量进行了测定,与化学发光酶联免疫分析测定结果无显著性差异,说明所建立的方法准确适用。对给予青娥方两个月的老年大鼠血清雌激素水平测定结果表明,青娥方能升高老年大鼠血清孕酮水平。
采用UPLC/MS/MS法建立了实验动物脑组织中单胺类神经递质的含量测定方法。在3.5min内实现了5-羟色胺(5-HT)及其前体L-色氨酸(Trp)、5-羟色氨酸(5-HTP)和代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲肾上腺素(NE)、L-多巴胺(DA)、肾上腺素(E)及其前体L-多巴(DOPA)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-酪氨酸(Tyr)共10个化合物的分离。应用该方法分析了青娥方对老年大鼠脑组织单胺类神经递质的影响以及补骨脂素、补骨脂定、补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚对去卵巢小鼠脑组织单胺类神经递质的影响。结果表明,青娥方0.5g/kg能升高老年大鼠脑组织中5-HT和DA的含量,青娥方2.0g/kg能升高老年大鼠脑组织中5-HTP、5-HT、5-HIAA、DA、NE的含量;补骨脂素psoralen64mg/kg能升高去势小鼠脑组织Trp、5-HTP的含量,补骨脂异黄酮corylin64mg/kg能升高去势小鼠脑组织Trp、5-HTP、DOPA、NE的含量,补骨脂定psoralidine16mg/kg能升高去势小鼠脑组织Trp、DOPA.的含量,补骨脂二氢黄酮甲醚bavachinin64mg/kg能升高去势小鼠脑组织Trp、DOPA.的含量:bavacbinin16mg/kg能升高去势小鼠脑组织Trp、5-HTP、5-HT、5-HIAA、DOPA、DA、NE、E的含量。青娥方和活性化合物对单胺类神经递质的调节作用提示,青娥方可能用于治疗围绝经期潮热、抑郁症和睡眠障碍,但还需要进一步的更有针对性的药理实验加以证明。
三、青娥丸的质量标准研究
在化学成分研究和药效学评价基础上,以杜仲对照药材、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、栀子苷为对照,建立了青娥丸中杜仲的专属性定性TLC鉴别方法;以补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂异黄酮为对照,建立了青娥丸中补骨脂的专属性定性TLC鉴别方法。分别建立了青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的HPLC含量测定方法以及补骨脂素、异补骨脂素的HPLC含量测定方法。据此修订了青娥丸的质量标准,并被《中国药典》(2010年版一部)收载。
此外,采用超高效液相色谱(UPLC)法测定了青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量,对中成药这一复杂体系的质量标准研究中新技术、新方法的应用做了一些有益尝试。同时还建立了青娥丸中包括黄酮类、香豆素类、苯并呋喃苷类、杂萜类15个酚性成分的HPLC定量分析方法,为深入评价青娥丸的质量奠定了方法学基础。该方法不仅可以用于青娥丸及补骨脂药材的分析,也可以应用于其他组方中含有补骨脂药材的中成药的分析研究。