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研究背景及目的:世界卫生组织和欧美地区大规模的研究结果表明,药物安全性问题是住院病人致死的最重要原因之一,占全部死亡原因的第五位[1,2]。硫嘌呤类药物,如6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)和硫唑嘌呤(azathiopurine,AZA),是类嘌呤拮抗剂,能够干扰核苷酸代谢,具有抗增殖和免疫抑制的作用。在临床上这类药物主要用于炎症性肠炎、急性白血病的化疗或作为免疫抑制剂广泛用于器官移植以及自身免疫性疾病的治疗。硫嘌呤类药物本身并无活性或活性很低,它们在体内需经过酶催化生成6-硫鸟苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)而发挥药理作用。硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine S-methyltransferase,TPMT)是硫嘌呤类药物在体内代谢的关键酶,其编码基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可以决定TPMT活性,进而直接影响硫嘌呤类药物的临床疗效和毒性的程度[2-4]。目前对于TPMT的检测主要有表型及基因型两种。表型检测的准确性受到输血,药物相关作用等因素的影响较为明显。基因型检测不会受到上述因素的影响,同时也更为快速和简便。基因型检测法正逐步取代表型检测法,成为TPMT活性检测的主流手段。如何快速、全面、系统、准确的进行TPMT基因型检测是当前的热点问题。本课题研究探索并优化TPMT基因PCR扩增反应的最佳体系,制备了TPMT基因的37种SNP位点。寻找适合每一种SNP位点的内切酶,并确定其被酶切后的片段大小。根据酶切后的片段大小、酶切时孵育的时间和温度等条件来确定合适的内切酶组合。方法:1.利用NCBI的GenBank查找TPMT基因全序列,然后从TPMT基因全序列中查找TPMT外显子(exon)3-10的序列。合成TPMT外显子3-10的特异性引物,并对反应体系中引物浓度及PCR的退火温度等进行条件优化,建立聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增体系。利用琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)鉴定扩增引物的特异性和扩增片段的大小。2.使用优化后的PCR体系方法来扩增TPMT exon 3-10基因序列,然后将扩增好的PCR产物送上海生工进行目的基因PCR克隆测序(要求提供克隆测序结果、宿主菌和纯化好的质粒。对纯化后的质粒具有如下要求:每种质粒至少提供1毫升,浓度为1x10e7copies/ul以上,拷贝数越大越好。同时要求pcr产物末端带有a尾。)。用blast软件把克隆测序结果和模板序列进行比对,以确定扩增出的外显子序列的正确性。比对无误后进行点突变,依据37种不同的snp位点,将序列中的一个碱基突变成另一个碱基。具体的碱基突变位置如下:exon3(tpmt*03e:rs3931660t140+114a、tpmt*13e:rs72552742a83t、tpmt*14:rs9333569a1g、tpmt*17:ndc124g、tpmt*29:rs267607275t2c、tpmt*30:ndg106a);exon4(tpmt*03e:rs12529220a141-101t、tpmt*5:rs72552740t146c、tpmt*18:nd211g>a、tpmt*21:rs200591577c205g);exon5(tpmt*02:rs1800462g238c、tpmt*03d:rs72552739g292t、tpmt*03e:rs2518463t366+58c、tpmt*09:rs151149760a356c、tpmt*19:nda356c、tpmt*27:ndt319g、tpmt*28:ndg349c、tpmt*32:rs115106679g340a、tpmt*34:rs111901354c244t);exon6(tpmt*11:rs72552738g395a、tpmt*12:ndc374t);exon7(tpmt*03b:rs1800460g460a、tpmt*03e:rs2842934c474t、tpmt*10:rs72552737g430c、tpmt*16:rs144041067g488a、tpmt*22:ndg488c、tpmt*33:rs112339338c487t);exon8(tpmt*15:rs9333570g495-1a、tpmt*06:rs75543815a539t、tpmt*23:rs74423290c500g、tpmt*24:rs6921269g537t);exon9(tpmt*26:rs72556347t622c、tpmt*31:rs79901429t611c);exon10(tpmt*04:rs1800584g626-1a、tpmt*03c:rs1142345:a719g、tpmt*07:rs72552736t681g、tpmt*08:rs56161402g644a、tpmt*20:rs150900439a712g、tpmt*25:ndt634c)。野生型序snp列采用pucm-t质粒载体,此载体是为简化pcr产物的克隆而设计的,适用于3’-末端带有a尾的pcr产物克隆。突变型snp序列使用puc57质粒作为载体。共制备了37种tpmt基因snp位点。3.利用dnassist软件分析查找tpmt37种snp位点最合适的内切酶,但其中有10个snp位点没有找到合适的内切酶。因此通过错配碱基的方法(使用primerprimer5软件来设计错配碱基的引物)确定合适的酶。利用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切后的片段的大小。通过酶切后的片段大小、内切酶的孵育时间和温度等条件对内切酶进行组合,同时要求同一组合中酶切后的片段的大小至少相差5bp。结果:1.通过聚合酶链式反应确定最优的反应条件为:引物浓度为0.4?m,探针浓度为0.1?m,退火温度为55℃。2.将得到的8个外显子pcr产物进行克隆并依次测序,通过与标准序列进行对比确定得到的各个外显子序列的正确性。经过BLAST比对,两者序列匹配。克隆出的TPMT外显子为野生型序列。为了得到突变型序列,我们依据突变型的TPMT SNP位点分布,对不同的SNP位点进行点突变。通过这一步骤得到了突变型的TPMT SNP序列。通过上述步骤成功构建了TPMT基因的37种SNP位点(野生型和突变型)。3.使用不同的内切酶切来识别TPMT基因的37种SNP位点,利用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段的大小。通过分析酶切后的片段大小、酶切孵育的时间和温度对其不同的酶进行合理组合,使其可以全面、更快的判断来未知样本的SNP位点情况。结论:1.本研究优化了TPMT基因外显子3-10扩增反应体系,利用琼脂糖凝胶电泳鉴定了TPMT基因外显子3-10扩增产物的正确性。2.利用不同的质粒载体构建了37种野生型和突变型TPMT基因SNP位点。3.获取了37种SNP位点相对应的内切酶,确定了每种SNP位点经酶切后片段的大小。通过分析酶切后的片段大小、酶切时孵育的温度和时间等条件来对其不同的酶进行合理组合,使其可以全面的判断未知样本的SNP位点情况。为今后进一步的产品开发(如基因探针)奠定基础。