研究背景和目的热射病(heatstroke)是中暑最严重的情况,是由于长时间暴露在高温环境导致。临床上对于热射病的定义包括核心体温超过41℃,发热,皮肤潮红干燥,和中枢神经系统功能障碍。重症中暑常合并多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),重症中暑MODS的病理生理学反应并非只是热暴露的直接损伤所致,而是一种继发于热损伤后的系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),进而导致MODS的过程。越来越多的证据表明,重症中暑虽然由高热诱发,但是其具体的发生、发展则是由多种细胞因子介导的系统性炎症反应所驱动。根据劳力性因素的有无,热射病可分为经典型(也就是被动型)和劳力型两种类型。经典型热射病(classic heat stroke,CHS)是暴露在高温环境下被动发生,典型情况下是发生于免疫受损的及老龄化的人口,该类人群在热浪袭击下死亡率上升。其它一些热打击前的因素,如精神系统疾病,酗酒,或药物(如利尿药,抗胆碱药),也是经典型热休克的易感因素。相反的,劳力型中暑(exertional heat stroke,EHS)通常发生于健康、年青的个体,于高温环境下剧烈运动时发生。运动员和士兵是代表性的两类高危人群,尽管这类人群有一定的热习服可以使发病率下降。就研究而言,以往多数以经典型中暑为主,研究范畴涉及发病机制、临床研究、病理、病理生理等各个方面,但是关于劳力性热射病的研究国内外较少。近年来的研究表明,肠道一直被作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”,以其在体内独特的生理环境参与SIRS和MODS的病理生理过程,肠道及肝脏有着共同的胚胎起源,故其存在各种解剖和内在功能联系,肝脏主要通过清除逃逸胃肠粘膜免疫监视的抗原和炎症因子从而发挥第二水平的保护作用。大量研究表明肝脏亦常为重症中暑首发热打击损害脏器,肠源性内毒素清除的第二道屏障遭到破坏,从而形成肠肝轴保护功能障碍。因此基于肠源性内毒素经门静脉由肝入体循环这一经典观点,及结合热射病时肝脏的病理变化,我们推测：高热的直接细胞毒作用可造成枯否细胞的原发性损伤,损伤的枯否细胞吞噬功能下降,其清除内毒素能力减弱,同时枯否细胞又被肠道泄露的内毒素所活化,产生大量的炎症因子,同时激活肝窦内皮细胞损伤,造成肝脏微循环障碍,导致肝细胞损伤,枯否细胞产生的炎症介质入血进一步激活全身炎症细胞,形成全身炎症反应；另一方面枯否细胞对于肠源性内毒素清除障碍,致肠源性内毒素溢出网状内皮系统进一步激活循环或组织中的的炎症细胞,形成炎症瀑布,造成机体多脏器炎症损害和血管内皮细胞的损伤导致MODS的产生。基于这一假设,本研究先是分别制备劳力型和经典型重症中暑大鼠模型,研究两种类型重症中暑发生发展过程中生命体征、存活时间的改变,初步明确两种不同类型重症中暑发生发展过程中机体的病理生理反应过程及区别。然后于中暑的不同时段收集大鼠血浆及肝脏病理标本,检测大鼠血中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α),白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),白介素-6(Interleukin-6,IL-6),内毒素(LPS)水平变化及对大鼠肝脏的功能形态学变化及病理损伤的影响；体内通过打印度墨水及体外分离大鼠肝脏枯否细胞研究其吞噬功能的变化,进而探讨EHS枯否细胞活化致肝损伤及系统炎症因子水平变化的机制,为提高救治水平,降低其致死、致残率提供实验依据和新的防治思路。方法1.劳力型热射病及经典型热射病大鼠模型的构建通过六道计算机控制多功能动物跑台和高温模拟气候舱,构建EHS动物模型和CHS动物模型；监测核心体温和动脉收缩压变化,对比核心体温、动脉收缩压调节反应和生存时间。2.检测EHS及CHS大鼠肝脏枯否细胞的吞噬功能及外周血内毒素含量大鼠成模后,经鼠尾静脉注射用生理盐水1：3稀释的印度墨汁(0.25m1/100g)。计算吞噬指数k的校正值a;HE染色,镜下观察枯否细胞(KC)并计数,体外分离枯否细胞,流式检测其对溶菌酶的吞噬情况,从而对比两种不同模型枯否细胞的吞噬能力。采用免疫酶联反应方法检测血中内毒素浓度。3.检测EHS及CHS大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST水平及观察各组肝脏病理学变化采用免疫酶联反应方法检测血中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度,通过全自动生化仪同步检测ALT、AST指标。采用苏木素-伊红染色观察正常对照组、EHS组,CHS组大鼠肝脏的形态学变化及病理学变化。4.统计学处理数据以均数士标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验；不同时间点的差异采用协方差分析。结果1.EHS和CHS组大鼠表现为不同的核心体温和血压调节特征。尽管最大核心体温无显著差异,但是对比CHS组大鼠,EHS组大鼠核心体温上升速显著加快(P<0.05),成模时间显著缩短(P<0.05),总热负荷和严重热负荷均显著减少(P<0.05),预后也更差(P<0.05)。2.与正常对照组相比,EHS及CHS组KC的数目和吞噬指数k的校正值a明显降低,EHS组KC的数目和吞噬指数k的校正值a低于CHS组,差异有显著统计学意义。体外分离枯否细胞,与CHS组相比,流式结果示EHS组对溶菌酶的吞噬能力降低。与对照组相比,CHS组及EHS组外周血中的内毒素(ET)浓度明显增高,与CHS组相比,EHS组外周血内毒素水平升高更显著,差异有统计学意义(P<0.05)3.与对照组相比,IL-6、IL-1β、TNF-α、ALT、AST的表达有差异,具有统计学意义(P<0.000);EHS组内毒素、IL-6、IL-1β、TNF-α、ALT、AST水平明显增高,与对照组相比,有极其显著差异,与CHS组相比,EHS组内毒素、IL-6、IL-1β、TNF-α、ALT、AST水平增高(P<0.05),差异有统计学意义。比较各组肝脏的病理学改变,与对照组相比,CHS组在汇管区可见炎症细胞浸润,未见明显肝细胞水肿,可见局灶出血；EHS组可见肝细胞广泛细胞水肿,肝细胞排列紊乱,可见片状出血。讨论热射病(heatstroke, HS)是一种重症疾病,发病率和死亡率高。以往的研究中多数以经典型中暑动物模型为主,劳力型中暑的研究多集中在临床病人,由于伦理学的限制及其无法获得非劳力的正常对照,诸如此类的困难使得动物实验的重要性变得十分突出,建立劳力型热射病动物模型可以更好的了解劳力型中暑的病理生理过程,同时劳力型中暑也更符合人类中暑的特点。在本研究中,劳力型热射病组大鼠在热暴露期间表现出与经典型不同的核心体温调节特征,其并未经历如同经典型中暑体温调节的典型的三相式模式,而直接呈线性增高至血压从峰值开始下降时的最高核心体温,尽管两种模型在最大核心体温上无显著差异,然而对比经典型热射病大鼠,劳力型热射病大鼠的核心体温上升速率显著加快,成模时间(总热暴露时间)显著缩短。尽管热负荷定量分析显示,劳力型热射病大鼠的总热负荷和严重热负荷均显著少于经典型热射病大鼠,但其预后更差,并且大部分在热暴露后的12h内发生死亡。我们推测可能运动导致机体的产热增加,使得大鼠体温快速到达体温调节阈值的上限,使得机体丧失调节能力,从而加速了热射病的发生。枯否细胞为固定在肝内的巨噬细胞,占肝脏总体积的2.1%,承担体内单核巨噬细胞功能的80～90%,其不仅具有吞噬、免疫调节功能,还能合成、分泌多种生物活性物质,作为机体清除内毒素的主要场所同时也是内毒素的重要的靶细胞。一方面,枯否细胞具有清除内毒素的功能(吞噬功能)；另一方面其又可被内毒素所活化,产生大量炎症介质等活性物质(分泌功能)。在本研究中,比较各组肝脏的病理学改变,与对照组相比,CHS组在汇管区可见炎症细胞浸润,未见明显肝细胞水肿,可见局灶出血；EHS组可见肝细胞广泛细胞水肿,肝细胞排列紊乱,可见片状出血。EHS组肝脏病变较重,肝功能指标及外周血LPS水平均高于CHS组,这些病理变化提示：一方面高热可能造成肝脏的直接损伤,另一方面多种继发性损害因素对肝脏的再次损伤可能更为重要,而肠源性内毒素为一重要的肝损害继发因素。在本研究中,与正常对照组相比,CHS组外周血内毒素水平显著增高,但其枯否细胞吞噬功能却未受损,此时血中内毒素水平升高可能主要与肠黏膜通透性增高,肠黏膜屏障功能下降有关,而非KC吞噬功能下降所致。而劳力型热射病大鼠肝脏枯否细胞数目减少,吞噬功能显著降低,且外周血内毒素水平高于经典型热射病组,我们推测劳力型热射病大鼠肠粘膜屏障受损更严重使得进入门脉系统的内毒素高于经典型,高浓度的内毒素使得枯否细胞吞噬功能障碍,功能受损的枯否细胞对内毒素的清除能力减弱,进一步使得内毒素进入外周血中,这可能也是劳力型热射病大鼠外周血内毒素水平高于经典型的重要原因。EHS组外周血内毒素水平显著高于CHS组,肠源性内毒素溢出网状内皮系统进一步激活循环或组织中的的炎症细胞,形成炎症瀑布,也可以解释本研究中EHS组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平高于CHS组的原因,但本实验中并未直接检测枯否细胞的分泌功能是否发生亢进,枯否细胞是否是热射病大鼠早期炎症因子的主要来源需要做进一步验证。上述结果表明,枯否细胞吞噬功能障碍是内毒素肝损害的关键因素之一,枯否细胞吞噬内毒素能力减弱、诱导中性粒细胞浸润和损伤肝窦内皮细胞进而活化局部凝血系统是内毒素性肝损伤的关键因素,同时也是肠源性内毒素从网状内皮系统泄露到外周致全身炎症反应的重要因素,这可能也是EHS大鼠预后较CHS差的重要原因,这一过程可能参与了劳力性热射病致MODS、DIC的发生和发展。结论1.劳力型热射病大鼠模型相较与经典型热射病大鼠预后更差,炎症因子及内毒素水平升高更显著,肝功能受损更严重。2.劳力型热射病大鼠肝枯否细胞吞噬功能下降,但经典型热射病大鼠枯否细胞吞噬功能并未受损。