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葡萄糖调节蛋白78(GRP78)存在于内质网中,主要起分子伴侣的作用,在正常细胞中帮助蛋白质正确折叠与装配,同时,参与调节错误折叠蛋白的降解,内质网中Ca2+离子的结合和内质网应激信号活化。实体肿瘤通常处于低氧、低葡萄糖和PH酸性的微环境中,这些微环境因素可以通过内质网应激反应促进GRP78蛋白在肿瘤细胞中的表达。最新研究表明,GRP78在肿瘤细胞中可以转移到细胞表面,而在正常细胞的膜表面却没有观察到这种转移。所以,肿瘤细胞膜表面特有的GRP78蛋白就可以成为治疗肿瘤细胞特异的的分子靶点。我们前期研究发现,绿豆胰蛋白酶抑制剂赖氨酸活性片段mTI能够抑制大肠癌细胞SW480细胞的迁移,但对大肠癌细胞的增殖和存活却没有显著的影响。为了增强mTI的抗肿瘤效果和靶向性,本研究将GRP78结合肽WIFPWIQL与mTI蛋白通过基因工程手段构建成为融合蛋白GBP-TI,并从细胞和动物实验水平研究GBP-TI的靶向抗肿瘤作用。首先,以mTI表达质粒为模板,用含有WIFPWIQL表达序列的引物通过PCR扩增目的序列；构建GBP-TI蛋白的原核表达载体,IPTG诱导GBP-TI蛋白的表达；GST亲和柱纯化获得高纯度的GBP-TI蛋白。胰蛋白酶抑制剂活性检测结果表明,GBP-TI且有与mTI相当的胰蛋白酶抑制活性。免疫细胞化学染色表明,GBP-TI与大肠癌细胞表面GRP78存在共定位关系,。表明GBP-TI能够特异性靶向GRP78蛋白。然后,通过MTT法,流式细胞术和JC-1试剂盒对细胞的增殖活力,细胞周期和线粒体膜电位进行检测,同时,利用DAPI染色技术和、Western blot手段对细胞的凋亡小体和增殖、凋亡相关信号蛋白的影响和变化进行检测。实验结果发现,GBP-TI能够特异性的诱导G0/G1期阻滞,抑制大肠癌细胞增殖,其分子机制是通过抑制β-catenin介导的cyclin D1表达。GBP-TI还能够特异性诱导Bax/Bcl-2表达比例提高进而降低线粒体膜电位,活化线粒体凋亡途径,并激活内质网应激途径和死亡受体凋亡途径,从而特异性诱导大肠癌细胞凋亡。值得一提的是,GBP-TI对正常细胞的增殖和存活无明显影响,表现出它具有良好的抗肿瘤靶向性。进一步采用裸鼠成瘤实验从体内水平(in vivo)评价GBP-TI的抗肿瘤效应,结果表明GBP-TI能够明显的抑制肿瘤的生长,组织样本分析显示GBP-TI能够降低细胞增殖、存活相关蛋白cyclin D1、β-catenin、Bcl-2和Ki67的表达,而提高凋亡蛋白相关蛋白CHOP、caspase-3、Bax等蛋白的表达量,裸鼠的体内实验结果与细胞体外水平结果相一致。综上所述,本研究采用基因工程的方法构建了基于绿豆胰蛋白酶抑制剂、以细胞表面GRP78蛋白为靶点的重组靶向抗肿瘤活性分子GBP-TI。通过体内和体外实验证明重组GBP-TI能够特异、高效的诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常组织、细胞生长影响不明显,表现出其对肿瘤细胞的特异靶向性。本研究数据为多肽类肿瘤靶向药物的开发提供了一种新的实现策略,具有重要的理论意义和应用价值。