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脑胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的肿瘤,且其发病率随年龄增大有增高的趋势,具有侵袭性生长,无控性增殖,易复发等特点。传统的治疗方法包括手术、化疗和放疗,治疗效果差,不能明显的提高患者的生存率。特别是Ⅲ级(WHO分级)间变性胶质瘤和Ⅳ级(WHO分级)胶质母细胞瘤,因其高增殖及侵袭性生物学特性,虽经手术为主的联合放射及化学治疗,预后并没有得到明显改善,其平均生存时间分别仅为1.5年和9-12个月。胶质瘤本质上是一种多基因异常疾病,通常伴有原癌基因的过表达和抑癌基因的突变缺失,因此,在基因水平探讨胶质瘤的发病机制,从根本上纠正与胶质瘤发生,发展相关的基因异常,探索基因治疗方法已成为医学研究领域的热点。miRNA是一类长约19-24nt的非编码RNA,能够与靶基因的3’端非编码区(3’UTR)结合而抑制靶mRNA的翻译或使其降解,对基因表达起到转录后水平的调控作用。microRNA通过调控复杂的细胞信号通路网络和对细胞的多方面生物学行为影响,直接或者间接参与肿瘤的发生,发展。microRNA和肿瘤之间的密切联系已经成为医学科学研究领域的另一热点。近年来越来越多研究发现microRNA的异常表达与胶质瘤的发生、发展有着密切的关系。miR-21的高表达可以促进U251胶质细胞瘤的侵袭性生长,miRNA-128直接结合于Bmi-1mRNA的3’非编码区的一个结合位点,抑制Bmi-1致癌基因表达,抑制胶质瘤细胞增殖。MiR-451位于染色体17q11.2,与原癌基因人类表皮生长因子受体2的17q11.2-21区域临近。近年来有研究发现异常表达的miR-451与肿瘤的发生,发展有密切的关系。Gal等研究表明miR-451在恶性胶质瘤干细胞中低表达,miR-451联合抗肿瘤药甲磺酸伊马替尼能明显抑制胶质瘤干细胞的生长和增殖。在胃癌和结肠直肠癌中miR-451低表达,并且通过直接靶标癌基因巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)发挥抑癌因子的作用,miR-451高表达时能降低细胞的增值能力,增加细胞对放疗的敏感性,而低表达时与患者较差的预后密切相关。miR-451还可以通过抑制c-myc的表达明显抑制结肠癌细胞系SW620裸鼠皮下种植瘤的生长。另外,近年来亦有研究发现miRNA-451与肿瘤的耐药性有密切的关系。miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调p-Akt(Ser473)、bcl-2蛋白表达而逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,在乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/DOX中,过表达miR-451通过直接调控耐药基因MDR1的表达,增强细胞对阿霉素的敏感性。也有研究报道称卵巢癌多药耐药的癌细胞系A2780DX5和KB-V1中抑制miR-451或miR-27a的表达可导致MDR1的mRNA和蛋白水平的下降,从而增加细胞系对药物(长春碱、阿霉素)的敏感程度。本课题组在预实验研究中通过miRNA微阵列芯片杂交发现：6个胶质瘤细胞系中miR-451表达下调为正常脑组织的50%以下,miR-451在胶质瘤中作为抑癌因子可以明显抑制胶质瘤细胞系(LN229,U87和U251)的增殖,转移,侵袭,诱导细胞周期阻滞和促进胶质瘤细胞的凋亡。本课题组并对miR-451的作用机制进行了研究,通过生物学信息预测,western blot和荧光素酶等试验发现CAB39为miR-451的直接作用靶点,miR-451有可能通过直接靶标CAB39调控PI3K/AKT信号通路进而发挥肿瘤抑制因子的作用。为进一步研究miR-451的作用机制,寻找miR-451的直接作用靶点至关重要,以期为胶质瘤的临床治疗提供新的思路,本课题首先利用蛋白组学从整体上研究miR-451对胶质瘤细胞系U87基因的表达的影响并结合生物学信息预测软件miranda,预测出miR-451可能的直接作用靶点,然后再利用western blot和荧光素酶实验对预测出的可能的直接靶点进行实验验证。本课题研究分为以下三部分：第一部分将胶质瘤细胞系U87分成两组：未作任何处理的为对照组,应用寡核苷酸miR-451mimics转染的为处理组,培养24小时之后提RNA利用Real-time PCR检测miR-451的表达,利用iTRAQ试剂标记的蛋白组学技术整体上研究miR-451对胶质瘤细胞系U87基因表达的影响并结合microRNA的靶点预测软件miranda预测miR-451的可能的作用靶点。结果显示,与对照组相比,处理组基因表达差异≥1.5倍的有261种,其中143种基因表达是降低的,118种基因表达是升高的,261种差异蛋白中结合miranda软件预测出18种miR-451可能的直接作用靶点,包括10种表达降低的纂因和8种表达升高的基因。第二部分蛋白组学结合miranda软件预测的miR-451的可能的靶点中包括YWHAE基因,有文献报道YWHAE基因在乳腺癌,原发性肝癌和结肠癌中为促癌基因。本实验利用胶质瘤组织芯片的免疫组织化学技术和western blot技术,探究YWHAE基因在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达。结果显示,YWHAE基因的表达(14-3-3ε)在高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ和Ⅳ级)中明显高于低级别胶质瘤(WHO分级Ⅰ和Ⅱ级),并且胶质瘤组织的YWHAE的表达明显高于正常组织。与对照细胞系GES-1相比,胶质瘤细胞系(LN229,U87和U251)中YWHAE的表达明显增高。第三部分miR-451对胶质瘤细胞系(LN229,U87和U251)YWHAE表达的影响。本实验将胶质瘤细胞系(LN229,U87和U251)分成三组,未作任何处理的为对照组,转染无义序列的为scamble组和转染miR-451mimics的为处理组。利用Real-time PCR检测miR-451的转染效率以及miR-451在mRNA水平对YEHAE基因表达的影响,利用western blot检测miR-451对YWHAE基因表达的影响,利用双荧光素酶报告实验验证YWHAE基因是否为miR-451的直接作用靶点。结果显示,miR-451可以明显抑制YWHAE基因的表达,但是在mRNA水平对YWHAE的表达无显著影响,荧光素酶实验显示较control组、scramble组及pEZX-MT01-YWHAE-3’UTR-Mut组相比,共转染has-miR-451mimics和pEZX-MT01-YWHAE-3’UTR-wild质粒组相对荧光强度显著降低(P<0.01)。故可推断YWHAE是miR-451直接作用靶基因。结论：1、通过蛋白组学,本课题组成功预测出18种miR-451的可能的直接作用基因,其中包括YWHAE基因。2、与正常组织相比,YWHAE基因在胶质瘤组织中高表达,并且在高级别胶质瘤(WHO分级)组织中的表达高于低阶别胶质瘤。与对照细胞系GES-1相比,YWHAE基因在胶质瘤细胞系中亦是高表达的。3、在胶质瘤细胞系(LN229,U87和U251)中miR-451可以明显抑制YWHAE基因的表达,但是在mRNA水平对YWHAE基因的表达无显著影响。由双荧光素酶实验实验验证出YWHAE为miR-451的直接作用靶点。