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水稻是重要的粮食作物之一,水稻的分蘖和株高是组成水稻株型结构的两个最重要的农艺性状。在水稻基因组中有二个与拟南芥的控制侧芽生长的shoot-multiplication signal(SMS)途径中的MAX4同源的基因拷贝(OsCCD8a和OsCCD8b),本研究利用反向遗传学的方法证明了OsCCD8b是MAX4在水稻中的直系同源基因,控制分蘖的生长。(注:在我们实验进行过程中,日本学者Arite等(2007)通过对水稻的多分蘖矮杆突变体d10的鉴定,证明了D10基因就是OsCCD8b基因,正是MAX4在水稻中的同源基因。)我们通过RNA干扰(RNAi)获得的OsCCD8b表达下调的D10-RNAi转基因株系表现典型的多分蘖矮杆表型、其分蘖发生的动态及顶端优势现象都与d10突变体非常相似。据此,本论文在后续的研究中用D10-RNAi株系作为野生型水稻的对照来探讨D10基因的功能。
我们在抽穗后去除野生型水稻的穗子,发现去尖可促进上数第二茎节处的侧芽的生长,但对第一和第三茎节处的侧芽几乎没有影响;而且,在去尖的D10-RNAi植株中也能观察到类似的现象,但程度较弱。这一结果验证了Arite等(2007)最初的发现,即水稻也像其它许多植物一样具有顶端优势,虽然优势不强。对去尖前后的野生型和D10-RNAi植株不同部位的茎节中的内源生长素(IAA)含量的测定显示,在去尖后的野生型和D10-RNAi植株的第一茎节中的IAA含量都明显降低了,说明去尖确实引起了内源IAA的减少。但值得注意的是,去尖处理对D10-RNAi株系第一茎节中IAA含量的变化的影响要显著地大于对其第二茎节中IAA含量的变化,暗示第一茎节是检测在IAA和D10基因表达之间可能存在的相互作用的恰当部位。
我们在野生型水稻第一茎节中检测了D10基因的表达对生长素的反应。用外源IAA处理离体第一茎节后,D10基因的表达明显增强。用去尖的方法消除内源IAA后,D10基因在离体第一茎节中的表达受到明显的抑制,但这种抑制作用可被外源IAA对离体茎节的浸泡处理所恢复。然而,在同样的实验中没有发现IAA对D10的上游基因HTD1明显的诱导或抑制效应,这暗示IAA在对水稻中的SMS途径的调控过程中最关键的是对D10基因的表达调控。与之相对的是,用外源细胞分裂素(CKs)处理能抑制D10基因在野生型水稻第一茎节中的表达,但作为对照的HTD1基因的表达却未受抑制,暗示在CKs与SMS途径的D10基因之间存在某种反馈调控的机制,以保持适当的水稻侧芽生长。
去尖后,在D10-RNAi植株和野生型的第一和第二茎节中的CKs生物合成基因OsIPT4、OsIPT5和OsIPT7的表达水平都有明显的增加,暗示源于茎尖的IAA在茎节中抑制水稻CKs合成基因的表达。对茎节中CKs含量测定的结果表明,在D10-RNAi植株第二茎节中的活性CKs的含量明显高于野生型,但其贮藏形式的CKs水平却明显低于野生型,暗示在D10-RNAi株系第二茎节中贮藏形式的CKs水平的降低是导致活性CKs水平增加的原因。同时,对第一茎节的CKs合成基因的表达分析则表明,在D10-RNAi植株的第一茎节中OsIPT4、OsIPT5、OsIPT7和OsIPT8基因的表达明显低于野生型对照,暗示D10对在第一茎节中的CKs合成基因的表达有促进作用。进而,我们通过去尖处理和去尖后用外源IAA对离体的第一茎节的浸泡处理证明了D10对CKs合成基因在第一茎节中表达的促进作用是通过IAA介导的。
D10-RNAi植株与野生型相比,其穗子明显变小,而且谷粒的产量也显著降低。RT-PCR分析表明,负责降解CKs的CKs氧化酶基因OsCKX2在D10-RNAi植株幼穗中的表达明显地高于野生型,而在其它器官中均未观察到OsCKX2表达的明显差异。由此推测,OsCKX2表达的上调可能是D10-RNAi株系穗子变小,产量降低的原因之一。