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家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)属于二分DNA病毒科二分浓核病毒属。BmBDV基因组由两个线性单链分子(VD1,VD2)组成。BmBDV主要在家蚕中肠细胞中复制,导致家蚕患浓核症类似症状。BmBDV基因组结构与细小病毒相似,复制方式与腺病毒类似。因此,BmBDV具有开发成兼具细小病毒与腺病毒特征的病毒载体的潜能。BmBDV通过重组外源基因,可以创建具有特定功能的病毒载体。如通过遗传改造开发成新型安全高效的生物杀虫剂。从东亚钳蝎中分离出的蝎毒素BmK ITa1是一种抑制型抗昆虫毒素,由65个氨基酸残基组成,具有对昆虫专一选择性的神经麻痹致死作用。在BmBDV重组病毒中引入蝎毒素BmK ITa1基因,是否能够增强BmBDV毒杀害虫的作用尚不清楚。本研究的主要内容包括:?构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体;?重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒对昆虫细胞和家蚕的感染性;?重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性;(4)BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。研究结果如下;(1)构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体。首先构建了BmK ITa1基因表达盒。将公司合成的两端携带酶切位点的BmK ITa1基因插入到杆状病毒立刻极早期基因启动子ie1和sv40加尾信号序列之间,构建成蝎毒素表达盒质粒pT-ie1-BmK ITa1-sv40。然后在BmBDV次要结构蛋白mcp基因中插入蝎毒素BmK ITa1表达盒,构建了重组蝎毒素病毒载体pVD2-mcp/BmK ITa1。(2)重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体对昆虫细胞和家蚕的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组(VD1,VD2)线性化后共转染Hi5昆虫细胞。与转染pUC119的对照相比,细胞在转染96小时后出现变圆,漂浮等症状,继续培养出现细胞破裂,与原病毒基因组(线性化的VD1,VD2)感染一致。使用特异性引物反转录PCR在病变细胞中检测到BmK ITa1基因的转录;使用His和VP单克隆抗体Western blot检测到蝎毒蛋白和病毒VP蛋白。将病变的Hi5细胞裂解液经桑叶涂布添食易感BmBDV家蚕幼虫,回感4天后幼虫出现厌食,痉挛,麻痹死亡等症状。表明重组的外源BmK ITa1基因能够在家蚕中肠中表达并增强BmBDV的毒力。(3)重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组(VD1,VD2)线性化后共转染小鼠成纤维细胞L929,在转染后细胞生长状态正常,直至转染后10d与空白对照细胞无明显差异。使用反转录PCR未检测到蝎毒素基因的转录;Western blot也未检测到病毒VP蛋白的表达,说明在转染后L929细胞中没有病毒粒子产生,初步认为重组蝎毒素BmBDV载体不感染哺乳动物细胞。(4)BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。使用Blast搜索序列相似蛋白,进化分析结果显示VD1的ns1和vp基因与浓核病毒的ns1和vp基因同源,DNA聚合酶polB与真核生物自合成DNA转座子(波林顿转座子)中的聚合酶基因同源,ns1和vp基因在同一条链,推测该病毒起源于一个原始的单义浓核病毒,通过基因转移从波林顿转座子中获得了DNA聚合酶基因,并以浓核病毒单义向双义进化机制,组装基因组;VD2的NS3蛋白与颗粒体病毒和双义浓核病毒NS3蛋白同源,次要结构蛋白mcp基因来源于双链RNA呼肠孤病毒,推测VD2起源于一个原始的双义浓核病毒。终上所述,研究表明重组BmK ITa1基因加速家蚕幼虫的死亡,增强了BmBDV致病性;BmBDV对小鼠成纤维细胞L929无感染性,具备哺乳动物生物安全性;进化分析发现VD1起源于单义浓核病毒,VD2起源于双义浓核病毒。本研究对进一步了解BmBDV的特性及其用于病毒载体的研究具有重要意义。