心血管疾病是最重要的人类疾病之一,在欧美发达国家和中国都是导致人类死亡的的头号杀手。对心血管疾病的分子遗传学研究,不仅可提供精确的诊断方法,发展新的有效的治疗手段,同时还有助于我们理解心脏工作和血管发育的机理。在本研究中,我们克隆了一个新的血管生成因子,VG5Q, 其突变可引起先天性静脉畸形骨肥大综合征(Klippel-Trenaunay Syndrome,以下简称 KTS);在一个大的长 QT 家系中,我们发现了一个新的 KCNQ1 基因的突变,L187P, 该突变引起这一家庭的部分成员患有呈常染色体显性遗传的长 QT 综合征。KTS 是一类先天性血管疾病,其症状是毛细血管、静脉管、淋巴管畸形,以及骨和软组织肥大,可影响到身体的许多部位,出现疼痛、残疾和畸形,给病人带来极大的痛苦和精神压力。KTS通常散发,其发病原因尚不清楚。 本文通过定位克隆的方法克隆了一个新基因 VG5Q,并研究了该基因在血管生成过程中的生理功能。我们在一位发生了 t(5;11)(q13.3;p15.1)平衡易位的 KTS 病人身上分离淋巴细胞,通过体细胞杂交,获得了含衍生 5 号染色体和衍生 11 号染色体的人-仓鼠杂种细胞株。用 PCR 我们得到了两条染色体的精确的易位断裂点,使得我们能鉴定其附近的 KTS 候选基因,结果在 5 号染色体上的断裂点附近,克隆了一个在血管细胞中高度表达的基因,我们将之命名为 VG5Q. 在发生平衡易位 t(5;11)的病人中,易位断裂发生在 VG5Q 上游的启动子区或调控区内,距 VG5Q 的转录起始点仅 1274bp,在人脐带静脉内皮细胞中,带有易位的 11 号染色体部分 DNA 序列的 VG5Q 启动子,较野生型的表达活性提高约三倍,提示这位 KTS 患者的染色体平衡易位是一种导致 VG5A 过度表达的遗传缺陷。对 130 位散发的 KTS病人,我们进行了 VG5Q 的全部编码序列的突变检测,结果发现在 5 位患者中,都发生了相同的第三外显子的第 133 位密码子的 G-A替换,这一突变引起带负电荷的谷氨酸为带正电荷的赖氨酸所取代。对 200 位正常对照的 SSCP 分析未能发现这一突变。应用鸡胚尿囊绒膜检测,我们发现纯化的细菌表达的 VG5Q 蛋白能强烈地促血管生成;与血管生成因子 VEGF 相似,在含 VG5Q 的玻璃纤维滤纸周围可见轮状的丰富的新生血管。我们还发现野生型和 E133K 突变型 VG5Q 的促血管生成作用存在着显著的差异,突变型蛋白具有更强的促血管生成功能。我们认为,VG5Q 是一个 KTS 的致病基因。其根据如下:1,KTS 病人的平衡易位发生在 VG5Q 的启动子区域,而易位可使得内皮细胞的 VG5Q 表达增强三倍。2, 在 130 位 KTS 病人的突变检测中,有五位患者具有 VG5Q 的 E133K 突变,而在 200位正常对照中,我们未发现这一变化。3,VG5Q 在血管细胞中高度表达,而 KTS 的最主要症状是血管畸形。4,和血管生成因子 VEGF 相同,VG5Q 可强烈促进血管生成。5,和野生型 VG5Q 相比,E133K 突变型的 VG5Q 具有更强的促血管生成作用,表明这一突变是一种功能增强型突变。6,在 11 号染色体的易位断裂点附近 100kb 的范围内,尚未有基因被发现。所有这些,加上文献报道 KTS 患者病变部位的毛细血管和静脉管增多,强有力地支持我们的结论:VG5Q 是一种新的血管生成因子,它是第一个被鉴定的 KTS 的致病基因。 1<WP=5>复旦大学博士论文 先天性静脉畸形骨肥大综合征和长 QT 综合征的分子遗传学研究 长QT综合征是指心电图上有QT间期延长、易产生室性心律失常,尤其是尖端扭转性室速,患者易发生晕厥和猝死的一类心脏病。我们对一个具有 5 代人的呈常染色体显性遗传的长 QT 家系进行研究,我们选用了五个与 6 种长 QT 基因紧密连锁的微卫星标记(D11S4046、D7S798、D3S1277、D4S402 和 D21S266)进行连锁分析,结果表明,该家系的致病基因与 LQT1 紧密连锁(Lod Score 为 6.11);对 KCNQ1 基因全部编码区的测序和 SSCP分析, 发现病人的第 187 号密码子发生T-C 的碱基替换,引起亮氨酸被脯氨酸取代的错义突变。SSCP和 RFLP 分析的结果,表明在此家系中,该突变与疾病共分离,而 200 位正常对照中则未发现该突变。 通过对该家系的基因诊断,发现在接受测试的 42 名成员中,31 位为突变基因的携带者,其中 26 位具有典型的 LQT1 的 ECGs 模式;18 位致病基因携带者具有正常或临界范围的 QTc(0.45±0.04 sec), 提示在这个 LQT1 家庭中,KCNQ1 基因中的 L187P 改变是一种外显率较低的遗传突变,而基因诊断对这类疾病的预防具有重要意义。