论文部分内容阅读
产羔率低是制约优质高效养羊业发展的主要瓶颈,而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。以分子标记为核心的多基因聚合育种技术能直接在DNA水平上对产羔性状的基因型进行选择,克服了常规育种耗时长,效果差的缺点,可快速提高育种效率。可见,寻找与产羔性状紧密连锁分子标记,研究目标基因的调控功能及表达水平,筛选调控产羔性状的功能基因,是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合,集成创新多基因聚合育种技术体系的基础和前提。本研究以对动物繁殖性状有重要调控作用的KITLG、KIT、KISS1和NGF基因为研究对象,采用PCR-RFLP和DNA测序技术研究这4个基因在布尔山羊、西农萨能和关中奶山羊中的SNPs及其与产羔数的关联性；用实时定量PCR技术检测这4个基因在山羊10组织中的相对表达量；克隆山羊KITLG、KIT和NGF基因的CDS区,并进行生物信息学分析；用数量遗传学分析方法研究了KITLG、KIT和KISS1基因聚合效应对产羔数的影响,为集成创新山羊产羔性状的多基因聚合育种技术体系提供试验依据和理论依据。主要研究结果如下：1、KITLG基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析山羊KITLG基因CDS区全长825bp,编码274个氨基酸。其与牛、猪、人和鼠的氨基酸序列相似性分别为98%,95%,85%和81%；对KITLG的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含141个α-螺旋,17个延伸链,8个β-转角和108个随机卷曲。KITLG基因在卵巢、乳腺和肾中的表达量较高。在KITLG基因中发现了6个SNPs,分别为g.4163G＞A,g.16474G＞T,g.17025C＞A,g.17278A＞G,g.17335T＞C和g.17453C>T。其中g.4163G>A SNP位于内含子3,其它SNPs位于3’UTR。g.16474G＞T和g.17025C＞A位点以及g.17278A＞G,g.17335T＞C和g.17453C>T在3个山羊品种中呈现强连锁不平衡(r2＞0.33)。g.16474G＞T和g.17025C>A位点组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,GGCC组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显著高于TTAA型个体(P<0.05),在关中奶山羊中,GGCC组合丛因型个体的第4胎和平均产羔数显著高于TTAA型个体(P<0.05)；在布尔山羊中,GGCC组合基因型个体的第4胎产羔数显著高于TTAA型个体(P<0.05)。g.17278A>G,g.17335T>C和g.17453C>T位点组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,GGCCCC和GACTCC组合基因型个体的第1胎产羔数显著高于GACTCT型(P<0.05),GACTCC组合基因型个体的平均产羔数显著高于GACTCT型(P<0.05)；在关中奶山羊中,GGCCCC组合基因型个体的第3胎和平均产羔数显著高于GACTCT型(P<0.05)；在布尔山羊中,GGCCCC组合基因型个体的第4胎和平均产羔数显著高于GACTCT型(P<0.05)。以上结果表明,KITLG基因能够作为产羔数的候选基因用于山羊多基因聚合育种。2、KIT基因的克隆、表达及其SNPs与产羔数的关联分析山羊KIT基因CDS区全长2925bp,编码974个氨基酸。其与绵羊、牛、猪和人的氨基酸序列相似性分别为99%,99%,94%和90%。对KIT的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含246个α-螺旋,223个延伸链,47个p-转角和458个随机卷曲。KIT基因在肾、卵巢、乳腺和子宫中的表达量较高。在KIT基因中发现了2个SNPs,其中g.88430T>A SNP位于外显子7,该突变导致第409个氨基酸由酪氨酸→天冬酰胺,g.120466G>A SNP位于3’UTR。在g.88430T>A位点,对于布尔山羊、西农萨能和关中奶山羊,TT基因型个体的平均产羔数显著高于AA基因型个体(P<0.05)；在g.120466G>A位点,对于西农萨能奶山羊,AA基因型个体的第3胎产羔数显著高于GG基因型个体(P<0.05)；在关中奶山羊中,AA基因型个体的第1胎产羔数显著高于GG基因型个体(P<0.05)；在布尔山羊中,AA基因型个体的第4胎产羔数显著高于GG基因型个体(P<0.05)。结果表明,KIT基因能作为山羊产羔数的分子标记用于山羊育种。3、KISS1基因的表达及其SNPs与产羔数的关联分析KISS1基因在卵巢和肌肉中的表达量较高。在KISS1基因中发现了6个SNPs分别为g.384G＞A,g.2124T＞A,g.2270C＞T,g.2489T＞C,g.2510G＞A和g.2540C>T,其中g.384G＞A SNP位于5’UTR,其它SNPs位于内含子1。在3个山羊品种中,g.2124T>A和g.2270C>T位点以及g.2510G>A和g.2540C>T位点呈现强的连锁不平衡(r2>0.33)。在g.384G>A位点,对于西农萨能奶山羊,AA基因型个体的第2胎和平均产羔数显著高于GG基因型个体(P<0.05);对于关中奶山羊,AA基因型个体的第3胎产羔数显著高于GA和GG基因型个体(P<0.05)。g.2124T>A和g.2270C>T组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C5(TTTC)和C6(TTTT)组合基因型个体的第4胎和平均产羔数显著高于C1(AACC)型个体(P<0.05)；在关中奶山羊中,C6(TTTT)组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显著高于C1(AACC)型个体(P<0.05)；在布尔山羊中,C3(TATC)和C6(TTTT)组合基因型个体的平均产羔数显著高于C1(AACC)型个体(P<0.05)。g.2510G>A和g.2540C>T组合基因型与产羔数的关联分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C1(AACT)组合基因型个体第3胎产羔数显著高于C2(AATT)和C5(GATT)型个体(P<0.05)。在关中奶山羊中,C1(AACT)组合基因型个体第3胎产羔数显著高于C6(GGCC)和C7(GGCT)型个体(P<0.05)。在布尔山羊中,C3(AATT)组合基因型个体平均产羔数显著高于C1(AACC)、C4(GACT)和C6(GGCC)型个体(P<0.05)。以上结果表明,KISS1基因能够作为产羔数的候选基因用于山羊育种。4、NGF基因的克隆、表达及其SNP与产羔数的关联分析山羊NGF基因CDS区全长726bp,编码241个氨基酸。其与牛、猪、犬、人和鼠的氨基酸序列相似性分别为99%,95%,92%,92%和83%,对NGF的氨基酸序列分析发现,其二级结构包含44个α-螺旋,50个延伸链,15个β-转角和132个随机卷曲。NGF基因在卵巢、子宫和肺中的表达量较高。在NGF基因中发现了1个SNP(g.705A＞G),位于外显子1。在g.705A>G位点,对于3个山羊品种,GG基因型个体的第2胎和平均产羔数显著高于AA基因型个体(P<0.05)。在西农萨能和关中奶山羊中,GG基因型个体的第3和4胎产羔数显著高于AA基因型个体(P＜0.05)。NGF基因的g.705A>G位点可作为山羊产羔数的分子标记用于山羊育种。5、KITLG、KIT和KISS1基因聚合对山羊产羔数的效应分析在西农萨能奶山羊中,C1(GGCCTTTTTT)组合基因型个体的第1胎和平均产羔数显著高于C5(GTCATTAACC)和C22(GTCATATACC)型个体(P＜0.05);C1(GGCCTTTTTT)、 C2(GTCATTTTTT)和C3(TTAATTTTTT)组合基因型个体的第3胎产羔数显著高于C11(GTCAAATTTT)、C15(GTCAAAAACC)和C17(TTAAAAAACC)型个体(P<0.05)。在关中奶山羊中,在关中奶山羊中,C16(GGCCTATTTT)组合基因型个体的第2胎和平均产羔数显著高于C4(GTCATTAACC)和C5(GGCCTTTATC)型个体(P<0.05)；C5(GGCCTTTATC)组合基因型个体第4胎产羔数显著低于C6(TTAATATATC)、 C9(TTAATTTATC)和C16(GGCCTATTTT)型个体(P<0.05)。在布尔山羊中C1(GGCCTTTTTT)、C3(TTAATTTTTT)和C6(GGCCTTTATC)组合基因型个体的平均产羔数显著高刁C5(GTCATTAACC)和C8(GTCATTTATC)型个体(P<0.05)。统计分析结果表明,在西农萨能奶山羊中,C1(GGCCTTTTTT)为最佳组合基因型；在关中奶山羊中,C16(GGCCTATTTT)为最佳组合基因型,在布尔山羊中,C1(GGCCTTTTTT)为最佳组合基因型,其它优良组合基因型为C3(TTAATTTTTT)和C6(GGCCTTTATC)。