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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种严重危害人类健康的复杂血管炎性疾病,涉及内皮细胞活化、巨噬细胞浸润、基底膜的降解、平滑肌细胞增生以及细胞外基质改变和众多细胞因子的参与。当前在细胞水平上针对抗动脉粥样硬化的发病机制及药物研发等多以内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞为主。多方面研究证实中药罗仙子具有潜在的抗动脉粥样硬化作用,其脂类、蛋白及壳聚糖等提取物具有抗炎、抗氧化、抗菌及抗肿瘤等多方面的活性。我们课题组前期研究发现罗仙子蛋白提取物具有抗AS的作用。在此基础上,我们进一步分离出罗仙子低分子量多肽(分子量<30KD)提取物,该部位对小鼠AS具有更显著的抑制作用,可有效保护小鼠动脉血管,稳定内膜功能。这说明罗仙子低分子量多肽提取物可能是通过调节血管功能稳态达到抗AS作用的。基于此,本研究拟借助内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞单独及共培养平台,探讨罗仙子低分子量多肽提取物对致LPS诱导的内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及细胞间增殖、迁移、分泌功能等的影响,从细胞水平上阐明罗仙子抗AS的作用及部分机制。研究目的1.明确罗仙子多肽提取物对LPS介导的EC及其与SMC、Mφ共培养下细胞间相互影响的调节作用;2.明确罗仙子多肽提取物对LPS介导的SMC及其与EC、Mφ共培养下细胞间相互影响的调节作用;3.明确罗仙子多肽提取物对LPS介导的Mφ及其与、SMC共培养下细胞间相互影响的调节作用。研究方法1.罗仙子多肽提取物对LPS介导的EC及其与SMC、Mφ共培养下的调节作用:分离培养血管内皮细胞,分别采取免疫荧光、流式细胞术观察细胞表面分子CD31的表达和在细胞外基质胶上小管形成情况试验对所培养细胞进行鉴定。首先利用LPS对EC进行刺激诱导建立EC炎症模型,然后进行EC单独培养、EC/SMC和EC/Mφ共培养的同时与辛伐他汀类药物、不同剂量的罗仙子低分子量多肽提取物进行共孵育,同时设立空白对照组和模型组(阴性对照组)。分别ELISA法检测培养液上清中IL-6、TNF-α和VEGF水平;结合Boyden chamber分析及划痕实验检测细胞迁移情况;流式细胞术结合MTT实验检测细胞增殖情况。2.罗仙子多肽提取物对LPS介导的SMC及其与EC、Mφ共培养下的调节作用:分离培养血管平滑肌细胞,分别采取免疫荧光、蛋白免疫印记技术和流式细胞术观察α-SM的表达情况,对所培养细胞进行鉴定。首先利用LPS对SMC进行刺激诱导建立炎症模型,后续实验步骤及检测指标和方法参照1。3.罗仙子多肽提取物对LPS介导的Mφ及其与EC、SMC共培养下的调节作用:分离培养骨髓细胞,经M-CSF诱导成Mφ后,分别采取快速瑞士-吉姆萨染色法观察细胞形态学染色、免疫荧光和流式细胞术观察CD11b/c的表达、墨汁吞噬实验验证细胞吞噬功能等方法,对所培养细胞进行鉴定。利用LPS对Mφ进行刺激诱导建立炎症模型,后续实验步骤及检测指标和方法参照1。4.数据统计与分析:实验所得数据以均数与标准差(sx±)表示,借助SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。当各组数据方差齐时,采用LSD法进行比较;当方差不齐时,采用Dunnett T 3法进行比较。P﹤0.05时,差异有统计学意义。实验结果1.罗仙子多肽提取物对LPS介导的EC及其与SMC、Mφ共培养下的调节作用:所分离培养细胞形态学、免疫组织化学和在细胞外基质胶上均具备内皮细胞特征,并且细胞纯度较高。经LPS诱导后促进EC增殖(P﹤0.01);在EC单独培养下,辛伐他汀和各个不同浓度罗仙子处理后对EC的迁移、增殖有抑制作用,并降低了TNF-α、IL-6和VEGF的水平(P﹤0.01);在EC/SMC共培养下,5、80μg/ml罗仙子在一定程度上处理后对EC的迁移、增殖和TNF-α、IL-6、VEGF等细胞因子水平有抑制作用;辛伐他汀处理组却对细胞无明显影响(P>0.05);在EC/Mφ共培养下,辛伐他汀和不同浓度罗仙子处理后对EC的迁移、增殖有抑制作用,并在一定程度上降低了TNF-α、IL-6和VEGF的水平(P﹤0.01)。2.罗仙子多肽提取物对LPS介导的SMC及其与EC、Mφ共培养下的调节作用:细胞形态学和免疫组织化学均具备平滑肌细胞特征,并且细胞纯度较高。经LPS诱导后促进SMC增殖(P﹤0.01);在SMC单独培养下,20、80μg/ml罗仙子处理后在一定程度上对SMC的迁移、增殖和TNF-α、IL-6、VEGF等细胞因子水平有抑制作用,而辛伐他汀处理组却对细胞无明显影响(P>0.05);在SMC/EC共培养下,辛伐他汀和20、80μg/ml罗仙子处理后对SMC的迁移、增殖有抑制作用,并降低了TNF-α、IL-6和VEGF的水平(P﹤0.01);在SMC/Mφ共培养下,不同浓度罗仙子处理后在一定程度上对SMC的迁移、增殖和TNF-α、IL-6、VEGF等细胞因子水平有抑制作用,而辛伐他汀处理组却对细胞无明显影响(P>0.05)。3.罗仙子多肽提取物对LPS介导的Mφ及其与EC、SMC共培养下的调节作用:经M-CSF诱导后,细胞形态学、免疫组织化学和吞噬功能均具备巨噬细胞特征,并且细胞纯度较高。经LPS诱导后促进Mφ增殖(P﹤0.001);在Mφ单独培养下,辛伐他汀和各个不同浓度罗仙子处理后对Mφ的迁移、增殖有抑制作用,并降低了TNF-α、IL-6和VEGF的水平(P﹤0.01);在Mφ/EC共培养下,5μg/ml罗仙子处理后对Mφ的增殖有促进作用(P﹤0.01),但对细胞迁移和炎症水平无明显影响(P>0.05);20、80μg/ml罗仙子处理组抑制细胞增殖同时降低TNF-α、IL-6和VEGF的水平(P﹤0.01);辛伐他汀组可抑制细胞迁移(P﹤0.01),但对细胞增殖和炎症应激水平无明显影响(P>0.05)。在Mφ/SMC共培养下,80μg/ml罗仙子处理后在一定程度上对Mφ的迁移、增殖有促进作用(P﹤0.01),但对TNF-α、IL-6、VEGF等细胞因子水平无明显影响(P>0.05),而辛伐他汀处理组对细胞无明显影响(P>0.05)。结论罗仙子多肽提取物可以降低EC、SMC、Mφ及相互间细胞对炎症应激水平,抑制细胞迁移和增殖,这可能是其通过调节血管功能稳态达到抗AS的作用机制之一。