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恶性肿瘤已成为危害全球的主要疾病，严重危害着人类的健康。肝癌是常见的原发性恶性肿瘤之一，其致死率排全球恶性肿瘤致死率第三位。目前多数患者通过化疗、放疗及手术的方法治疗肿瘤，但效果仍有待提高，而肿瘤免疫靶向治疗作为全新的治疗模式正逐渐被人们所接受。近年来，活化的CD4+T细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用越来越受到人们的重视。它不仅具有免疫记忆和直接杀伤肿瘤细胞的功能，而且能辅助CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。但因其活性不佳且缺乏靶向性，限制了其在临床上的应用。因此，利用双特异性适配体有效地介导活化的CD4+T细胞靶向到肿瘤局部，提高细胞免疫治疗的抗肿瘤效果，将为细胞免疫治疗在临床上的应用提供一个新的治疗策略。 目的:运用Cell-SELEX技术，体外筛选获得活化的CD4+T细胞适配体，并对其进行生物学功能鉴定。与肝癌细胞适配体TLS9a合成双特异性适配体，探讨其能否引导活化的CD4+T细胞靶向肿瘤细胞，产生抗肿瘤效应。 方法:利用Cell-SELEX筛选法，以活化的CD4+T细胞为正筛细胞，以未活化的CD4+T细胞为反筛细胞进行筛选。随着筛选轮数的增加，不断增加筛选压力，以此提高筛选效率。用流式细胞仪监测筛选进程，当随机文库的富集程度达到平衡时，对富集的PCR产物进行TA克隆测序。对测序结果进行二级结构分析，并选出最具有代表意义的寡核苷酸序列。用流式细胞仪检测这些序列的特异性和亲和力，筛选出特异性最好、亲和力最高的适配体候选序列Act12c。利用Act12c与肝癌适配体TLS9a合成双特异性适配体Act12c/TLS9a，通过流式细胞术验证其特异性结合能力。用细胞因子芯片检测Act12c/TLS9a对活化的CD4+T细胞释放细胞因子的影响。流式细胞术检测活化的CD4+T细胞与Act12c/TLS9a结合后对肝癌细胞的杀伤作用。在BALB/c小鼠体内构建肝癌移植瘤模型，经Act12c/TLS9a结合的活化的CD4+T细胞过继治疗后，观察荷瘤小鼠的肿瘤体积变化和存活时间。 结果:经过11轮的细胞筛选，获得了5条能够特异性结合活化的CD4+T细胞的候选适配体，分别命名为Act-4，Act-5，Act-12，Act-15和Act-20。这五条适配体平衡解离常数（Kd值）均处于纳摩尔级别，其中Act-12Kd值仅为4.12±2.36nM。并且5条适配体在4℃与37℃环境中均能与靶细胞特异性结合，其中Act-4和Act-12与靶细胞的结合能力几乎不受温度的影响。Act-12截短后的序列Act-12c与靶细胞的结合能力与原序列Act-12最相仿。双特异性适配体Act12c/TLS9a能特异性的结合活化的CD4+T细胞和肝癌细胞(H22)。经Act12c/TLS9a修饰的活化的CD4+T细胞与未经Act12c/TLS9a修饰的活化的CD4+T细胞的活化程度无明显差异。在靶细胞H22存在的情况下，经Act12c/TLS9a修饰的活化的CD4+T细胞的增殖系数比未经修饰的活化的CD4+T细胞高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。且经Act12c/TLS9a修饰的活化的CD4+T细胞的细胞因子(IL-2、TNF、IFN-γ)的释放水平比未经修饰的活化的CD4+T细胞高，差异具有统计学意义(P＜0.001)。经Act12c/TLS9a修饰的活化的CD4+T细胞能在体外靶向杀伤H22细胞，并能在体内有效地抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。 结论:利用Cell-SELEX技术筛选出与活化的CD4+T细胞高特异性、高亲和力结合的核酸适配体Act12，并成功对其进行截短优化得到Act12c。构建的双特异性适配体Act12c/TLS9能同时靶向活化的CD4+T细胞和H22细胞，特异性地引导活化的CD4+T细胞杀伤H22细胞，并在体内显示出明显的靶向抗肿瘤效果，为肿瘤的靶向免疫治疗提供了具有潜在临床应用价值的新策略。