研究背景和目的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种常见的血液系统恶性肿瘤,目前缓解治疗AML主要通过使用各种细胞毒性药物和造血干细胞移植。然而治疗之后患者的总生存率不超过12%,高死亡率主要与治疗相关的死亡、诱导化疗失败和早期的复发有关。因此,寻找能够增加AML治疗效果和减少其不良反应的药物,对改善AML的治疗具有重要的意义。目前,在急性髓系白血病的化疗方案中,以柔红霉素联合阿糖胞苷为基础的方案即DA方案是标准的诱导缓解治疗方案,据报道,该方案治疗18-60岁的患者的完全缓解率在65%-75%之间,长期的无病生存率为30%左右,剂量增加的诱导化疗能提高疗程的完全缓解率和缓解质量,但相关毒性亦随之增加,在诱导治疗过程中患者的死亡率为5%-10%。长期使用后出现的耐药性和严重的不良反应制约着其在临床上的发展和应用。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA）是一种有效的蛋白激酶C（PKC酶）激动剂,它通激活PKC调节细胞信号转导通路,影响细胞的增殖、分化、存活和凋亡。据文献报道,TPA对多种白血病细胞有很强的抑制增殖、诱导分化作用,而且增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。除此之外,TPA可以快速恢复骨髓抑制患者外周白细胞数如中性粒细胞数。在治疗白血病方面TPA已获准进行II期临床试验。因此本实验欲考察TPA联合DA方案是否会影响用药的有效性和安全性,通过体外细胞实验观察TPA联合DA方案对人白血病K562、HL-60细胞增殖抑制的影响,以及体内动物实验观察TPA对DA化疗方案引起的不良反应影响。方法1 TPA联合DA方案对白血病K-562、HL-60细胞增殖的影响1.1细胞培养人白血病细胞K562和HL-60用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃,5%CO2浓度,95%饱和湿度的无菌培养箱中培养,每隔3天传代1次。1.2 MTT法检测细胞增殖MTT法检测TPA和DA方案单用以及联合作用后对白血病K-562、HL-60细胞抑制率的变化,绘制量效曲线,并进行统计学分析。2 TPA对DA化疗方案不良反应的影响2.1 TPA对DA化疗方案所致昆明鼠死亡率的影响DA方案一次性大剂量尾静脉注射柔红霉素20mg/kg和阿糖胞苷500mg/kg,之后给予TPA 25μg/kg治疗,观察TPA对DA方案所致动物死亡率的影响。2.2 TPA对DA化疗方案骨髓抑制的影响小鼠尾静脉注射柔红霉素6mg/kg和阿糖胞苷150mg/kg,连续给药三天,建立DA方案小鼠骨髓抑制模型。一周之后尾静脉注射TPA（12.5、25、50μg/kg）,腹腔注射EPO 500IU/kg,皮下注射GCSF 10μg/kg,连续给药三天,观察TPA、EPO、GCSF能否减轻DA方案引起的骨髓抑制,比较各组外周血细胞计数的变化,并比较各组骨髓组织病理变化。2.3 TPA对DA化疗方案心脏毒性的影响小鼠尾静脉注射柔红霉素6mg/kg和阿糖胞苷150mg/kg,连续给药三天,建立DA方案小鼠心脏损伤模型。一周之后尾静脉注射TPA（6.25、12.5、25μg/kg）,腹腔注射EPO 500IU/kg,皮下注射GCSF 10μg/kg,腹腔注射右丙亚胺150mg/kg,连续给药三天,观察TPA、右丙亚胺、EPO、GCSF对DA方案引起的心脏损伤是否具有治疗作用,比较对各组血清CK-MB和心脏组织SOD、MDA的变化,并比较各组心脏组织病理变化。2.4 TPA对DA化疗方案肾脏毒性的影响在DA方案心脏毒性模型的基础上,观察TPA能否减轻DA方案引起的肾脏毒性,比较各组血清CRE、BUN、ALT、AST、TP、ALB、GLO和A/G的变化,并比较各组肾脏组织病理变化。结果1 TPA对DA方案的体外增效作用1.1 TPA、DA方案单用对K562、HL-60细胞增殖的影响TPA、DA方案单独作用K562细胞72h后,TPA的IC₅₀为2.12nmol·L^-1,DA方案的IC₅₀为DNR/Ara-c 27.37nmol·L^-1/136.85nmol·L^-1;TPA、DA方案单独作用HL-60细胞72h后,TPA的IC₅₀为1.68nmol·L^-1,DA方案的IC₅₀为DNR/Ara-c17.94nmol·L^-1/89.7nmol·L^-1,均在较低的浓度就能对这两种白血病细胞产生较强的抑制增殖作用。1.2 TPA联合不同浓度的DA方案对K562、HL-60细胞增殖的影响TPA(0.64nmol·L^-1)可以显著协同一定浓度范围内的DA方案(2.76nmol·L^-1-88.32nmol·L^-1)对K562细胞增殖的抑制作用,DA方案单用的IC₅₀为DNR/Ara-c27.37nmol·L^-1/136.85nmol·L^-1,当TPA与DA方案联合应用时DA方案的IC₅₀为10.16nmol·L^-1/50.8nmol·L^-1,与单用DA方案比下降了62.9%,有统计学差异（P<0.01）。TPA(0.32nmol·L^-1)可以显著协同一定浓度范围内的DA方案(2.76-88.32nmol·L^-1)对HL-60细胞增殖的抑制作用,DA方案单用的IC₅₀为DNR/Ara-c 17.94nmol·L^-1/89.7nmol·L^-1,当TPA与DA方案联合应用时DA方案的IC₅₀为7.08nmol·L^-1/35.4nmol·L^-1,下降了60.6%,有统计学差异（P<0.01）。1.3不同浓度TPA联合IC₅₀浓度的DA方案对细胞增殖的影响DA方案抑制K562细胞增殖的IC₅₀为DNR/Ara-c 27.37nmol·L^-1/136.85nmol·L^-1,DA方案抑制HL-60细胞增殖的IC₅₀为DNR/Ara-c 17.94nmol·L^-1/89.7nmol·L^-1,不同浓度的TPA联合IC₅₀浓度的DA方案同时作用于K562、HL-60细胞72h后,TPA对DA方案的增敏作用呈剂量依赖性,当TPA浓度高于0.32nmol·L^-1时,TPA联合DA方案的抑制率明显高于单用DA方案组和单用TPA组,有统计学差异（P<0.01）。1.4高浓度TPA联合DA方案对细胞增殖的影响临床试验发现,TPA8nmol·L^-1是人体可以耐受的最大浓度,若高于该浓度将会发生寒颤、体温升高等不良反应。因此选用该浓度TPA联合不同浓度的DA方案观察对K562、HL-60细胞增殖的影响。当DA方案浓度高于44.16nmol·L^-1/220.8nmol·L^-1时,TPA联合DA方案对K562细胞的抑制率明显升高,与DA方案单用组和TPA单用组比,有统计学差异（P<0.01）。当DA方案浓度高于11.04nmol·L^-1/55.2nmol·L^-1时,TPA联合DA方案对HL-60细胞的抑制率明显升高,与DA方案单用组和TPA单用组比有统计学差异（P<0.01）。2 TPA对DA化疗方案不良反应的影响2.1 DA方案毒性试验TPA能够显著降低DA方案引起的小鼠死亡,DA方案单用组动物的死亡率为61.5%,TPA联合DA方案组动物的死亡率为23.1%,与DA方案单用比下降了38.4%。2.2 TPA减轻DA方案引起的骨髓抑制建立DA方案骨髓抑制模型后予以TPA、EPO、GCSF治疗,发现中剂量、高剂量TPA均可以显著升高动物的体重,明显升高骨髓抑制小鼠外周血白细胞数、红细胞数、血小板数,与DA方案模型组比有统计学差异（P<0.05）。其中TPA联合EPO组对外周血细胞的作用最为显著。HE染色结果显示,TPA联合DA方案组与DA方案单用组比,TPA明显改善骨髓组织的病理状态,减少DA方案对骨髓组织的损伤。2.3 TPA减轻DA方案引起的心脏毒性建立DA方案心脏毒性模型后予以TPA、EPO、GCSF、右丙亚胺治疗,发现中剂量、高剂量TPA均可以显著升高动物的体重,显著升高心脏系数和肾脏系数,显著降低小鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心脏组织MDA水平并升高心脏组织SOD水平,与模型组比有统计学差异（P<0.05）。TPA明显改善心肌组织的病理损伤,包括对心肌纤维萎缩,脂肪细胞沉淀,心肌细胞水肿,淀粉样变性跟DA方案模型组比有明显的减轻。2.4 TPA减轻DA方案引起的肾脏毒性在DA方案心脏毒性模型的基础上,发现TPA可以显著降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮的水平,升高总蛋白、白蛋白的水平,并且改善肾脏组织的病理损伤。结论1 TPA可以协同DA方案对K562、HL-60细胞增殖抑制的作用2 TPA可以明显减轻DA方案所致的骨髓抑制、心脏毒性和肾脏毒性