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目的:心肌纤维化芪参颗粒是中医临床治疗心力衰竭的有效药物,之前已发现具有抗心肌纤维化作用,其机制尚不明确。在本实验中,我们探讨芪参颗粒通过抑制ras同源家族成员A(RhoA)通路和丝裂原蛋白激酶(MAPK)通路发挥作用,以及RhoA和MAPK通路对于细胞的增殖和迁移行为的影响。方法:1.雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠6周龄92只,其中80只以结扎左冠状动脉前降支方法制备心肌纤维化模型,12只大鼠只穿线不结扎,作为假手术组。造模后的大鼠随机分为模型组、芪参颗粒组和福辛普利组。芪参颗粒组大鼠采用芪参颗粒灌胃,生药剂量为18.66g/kg,为临床2倍等效剂量。福辛普利组采用福辛普利灌胃,剂量为1.2mg/kg。假手术组和模型组采用等量的生理盐水灌胃替代。各组每天灌胃一次,药物均以水溶,按照1ml/100g的量灌胃,持续4周。2.采用心脏超声测量大鼠心脏功能左室舒张末期容积(LVEDd)、左室收缩末期容积(LVEDs),并计算射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。3.采用苏木精-伊红(HE)染色观察心肌细胞排列,马松三色染色测量胶原容积分数(CVF),免疫组化测量⒈型和Ⅲ型胶原的平均光密度值(IOD)。4.采用放射性免疫法测量血清AngⅡ,采用生化分析仪测量大鼠心肌酶谱血清天冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT),肌酸激酶(CK),肌酸激酶同工酶(CK-MB),α-羟基丁酸脱氢酶(a-HBDH)。5.采用实时定量PCR法和免疫印迹法检测心肌组织MAPK和RhoA通路关键分子的mRNA和蛋白表达。6.采用新生大鼠提取成纤维细胞进行培养,用AngⅡ刺激以建立心肌纤维化的肌成纤维细胞模型并进行鉴定。将细胞分为五组,分别为空白对照组、模型组、芪参颗粒组、PD98059/法舒地尔组和丹酚酸B组。模型组AngⅡ浓度10-7mol/L,芪参颗粒浓度为1000 μ g/ml,丹酚酸B浓度100 μmol/L。通过酶联免疫实验测量细胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量。7.通过MTT实验和软琼脂集落形成实验检测细胞的增殖能力。通过划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力。8.通过实时定量PCR检测细胞MAPK和RhoA通路关键分子的mRNA表达。9.采用SPSS20.0软件进行统计分析。结果:1.给药4周后,模型组大鼠的LVEDd和LVEDs有明显上升(P<0.01),EF和FS显著减低(P<0.01),芪参颗粒组EF和FS比模型组显著下降(P<0.01)。2.HE染色结果显示,假手术组心肌细胞排列整齐,而模型组细胞排列混乱,存在炎性细胞浸润。芪参颗粒组比模型组结构更规则,炎性细胞浸润更少。马松染色结果显示,模型组有大量胶原沉积,芪参颗粒组和福辛普利组胶原沉积减少。模型组的CVF显著上升(P<0.01),芪参颗粒组CVF比模型组显著下降(P<0.01)。3.免疫组化结果显示,模型组Ⅰ型和Ⅲ型胶原的IOD明显上升(P<0.01,P<0.01)。芪参颗粒组的Ⅰ型和ⅢI型胶原沉积比模型组显著下降(P<0.01,P<0.01)。4.血清检测结果显示,模型组的Ang Ⅱ,AST,LDH,CKMB,CK和a-HBDH水平明显上升(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P=0.016,P=0.018)。跟模型组相比,芪参颗粒组的Ang Ⅱ,AST,LDH,CKMB,CK和a-HBDH血清指标显著下降(P<0.01,P<0.01,P=0.021,P=0.013,P=0.145,P=0.089)。5.RT-qPCR 结果显示,模型组 ERK,JNK,RhoA,ROCK1,ROCK2 和 MLC 的 mRNA水平明显上升(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01)。芪参颗粒组的ERK,JNK,RhoA,ROCK1和ROCK2比模型组显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。6.免疫印迹结果显示,模型组的 ERK,p-ERK/ERK,p-JNK/JNK,RhoA,ROCK1,ROCK2 和 p-MLC/MLC 的蛋白表达水平明显上升(P<0.01,P<0.01,P=0.025,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。芪参颗粒组的 ERK,p-ERK/ERK,p-JNK/JNK,RhoA,ROCK1,ROCK2 和 p-MLC/MLC 水平比模型组显著下降(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。7.成纤维细胞在光学显微镜下形态呈现长梭形。Vimentin荧光染料染色可见细胞质呈现绿色荧光。成纤维细胞a-SMA染色未见绿色荧光,肌成纤维细胞a-SMA染色可见胞质绿色荧光,提示肌成纤维细胞表达a-SMA。ELISA结果显示,模型组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原明显上升(p<0.05,p<0.05)。芪参颗粒组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原比模型组明显下降(p<0.01,p<0.01)。丹酚酸B组比模型组也明显下降(p<0.05,p<0.05)。8.MTT实验结果显示,模型组48h和72h的MTT值明显上升(p<0.05,p<0.01)。芪参颗粒组的MTT值比模型组明显下降(p<0.05,p<0.01)。丹酚酸B组的MTT值比模型组也显著下降(p<0.05,p<0.05)。平板克隆结果显示,模型组的克隆数明显上升(p<0.05)。芪参颗粒组的克隆数比模型组显著下降(p<0.01)。丹酚酸B组的克隆数比模型组也显著下降(p<0.05)。9.划痕实验结果显示,模型组的48h和72h划痕宽度明显下降(p<0.05,p<0.05)。芪参颗粒组的48h和72h划痕宽度比模型组显著增加(p<0.05,p<0.01,p<0.01)。丹酚酸B组的48h和72h划痕宽度也比模型组显著增加(p<0.05,p<0.05)。Transwell实验结果显示,模型组的穿越数明显上升(p<0.05)。芪参颗粒组的穿越数比模型组显著下降(p<0.01)。丹酚酸B组的穿越数也比模型组显著下降(p<0.01)。10.细胞RT-qPCR结果显示,模型组的ERK,RhoA和ROCK1的mRNA水平明显上升(p<0.01,p<0.01,p<0.01,p<0.01,p<0.05)。芪参颗粒组的 ERK,RhoA 和ROCK1水平比模型组显著下降(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。丹酚酸B组的ERK,RhoA水平比模型组也显著下降(p<0.01,p<0.01)。结论:1.芪参颗粒在心肌纤维化动物模型中通过抑制纤维化的过程发挥了保护心脏的作用。它抗纤维化的机制可能是通过抑制RhoA/ROCK和MAPK信号通路。针对AngⅡ-AT1R-RhoA和MAPK通路的关键分子能够给心肌纤维化提供一种可选择的治疗手段。2.芪参颗粒在心肌纤维化细胞模型中通过抑制纤维化的过程发挥了抑制心脏成纤维细胞增殖和迁移的作用,从而防止纤维化的进展。它抗纤维化的机制可能是通过抑制RhoA/ROCK和MAPK信号通路来起作用。3.RhoA通路和MAPK通路之间有密切的联系。它们相互影响、相互配合,不仅体现在细胞信号转导方面,也体现在细胞的增殖和迁移等生物学行为方面。