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目的：观察昆明山海棠配伍益母草(昆母)不同提取物对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-HFLS)增殖的抑制作用,了解其对RA-HFLS的细胞周期、细胞凋亡及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达水平的影响,从cyclin D1、bcl-2、bax及caspase-3基因水平探讨其作用于细胞周期及细胞凋亡的可能机制。同时观察昆母对丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路蛋白磷酸化的影响,探讨其可能的作用机制。方法：利用3-5代RA-HFLS为研究对象,分别给予昆母乙酸乙酯提取物、昆母氯仿提取物、昆母石油醚提取物及昆母正丁醇提取物处理24h、48h及72h,以CCK-8检测各提取物对RA-HFLS的生长抑制率,流式细胞仪检测24h各组的细胞周期及凋亡率；昆母乙酸乙酯提取物及氯仿提取物处理24h,利用qPCR检测Cyclin D1、VEGF、bcl-2、 bax及caspase-3表达水平,应用western bolt检测各组ERK、pERK、JNK、pJNK、 P38及pP38蛋白水平。结果：1.昆母各提取物对RA-HFLS增殖的抑制作用(1)昆母乙酸乙酯提取物：与零加药组比较,高剂量组能抑制24h的细胞增殖(P<0.05),而MTX组及所有提取物组均可抑制48h及72h的增殖(均P<0.01)。低剂量组48h的细胞增殖与MTX组相当(P>0.05),而中、高剂量组则比MTX组更强(均P<0.01)。与MTX组比较,低剂量组72h的抑制作用偏弱,而中、高剂量组则更强(均P<0.01)。(2)昆母氯仿提取物：与零加药组比较,24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖,而高剂量组抑制率稍高(P>0.05)；48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖(均P<0.01)。与MTX组比较,低剂量组48h的抑制作用相当(P>0.05),72h偏弱(P<0.01),而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强(均P<0.01)。(3)昆母石油醚提取物：与零加药组比较,24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖,而高剂量组抑制率稍高(P<0.05)；48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖(均P<0.01)。与MTX组比较,低剂量组48h的抑制作用相当(P>0.05),72h偏弱(P<0.01),而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强(均P<0.01)。(4)昆母正丁醇提取物：与零加药组比较,24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖,而高剂量组抑制率稍高(P>0.05)；48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖(均P<0.01)。与MTX组比较,低剂量组48h的抑制作用相当(P>0.05),低剂量组72h的抑制作用偏低(P<0.05),而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强(均P<0.01)。(5)相同浓度的昆母各提取物对RA-HFLS的抑制作用,时间越长,抑制作用越强,抑制率越高；相同作用时间点,药物浓度越高,对成纤维样滑膜细胞的抑制作用越强,抑制率越高。昆母各提取物对成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用,呈时间和剂量依赖性。2.昆母提取物对RA-HFLS细胞周期的影响干预24h,每组均与空白组比较G1期及PI。昆母氯仿、乙酸乙酯及石油醚提取物低剂量组G1期及PI均无变化(均P>0.05)。中高剂量组G1期明显升高,PI明显降低(均P<0.01)。昆母正丁醇提取物低、中、高剂量组G1期明显升高,PI明显降低(均P<0.01)。3.昆母提取物对P,A-HFLS凋亡的影响干预24h后,每组均与空白组比较。MTX组凋亡率明显升高(P<0.01)；氯仿及石油醚提取物低剂量组凋亡率无变化(均P>0.05)；乙酸乙酯及正丁醇提取物低剂量组凋亡率升高(分别P<0.05、P<0.01)；各提取物中、高剂量组凋亡率均明显升高(均P<0.01)。每组均与MTX组比较。所有提取物低剂量组凋亡率均偏低(均P<0.01)；氯仿、乙酸乙酯及正丁醇提取物中剂量组相当(均P>0.05)；石油醚提取物中剂量组凋亡率偏低(P<0.01))。昆母各提取物高剂量组凋亡率均偏高(均P<0.01)。4.昆母提取物对RA-HFLS血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期蛋白D1、Bax、bcl-2及caspase-3的影响(1)氯仿及乙酸乙酯提取物对VEGF表达的影响qPCR显示,与未加TNF-α组比较,TNF-α组VEGF表达升高(P<0.05)。与TNF-α组比较,MTX组(P(0.05)、乙酸乙酯提取物高剂量组及所有氯仿提取物组(均P<0.01)表达下降,乙酸乙酯提取物低剂量及中剂量组无变化(均P>0.05)。与MTX组比较,乙酸乙酯提取物低剂量组VEGF表达稍高(P<0.05),乙酸乙酯提取物中剂量组及氯仿提取物低剂量组当(均P>0.05),乙酸乙酯提取物高剂量组及氯仿提取物中、高剂量组偏高(均P<0.01)。(2)氯仿及乙酸乙酯提取物对cyclin D1表达的影响qPCR显示,与未加TNF-α组比较,TNF-α组cyclin D1水平明显升高(P<0.01),与TNF-α组比较,MTX组、乙酸乙酯各组及氯仿中、高剂量组cyclin D1明显降低(均P<O.01),昆母氯仿低剂量组cyclin D1水平变化不明显(P>0.05)。与MTX组比较,乙酸乙酯(P<0.05)及氯仿(P<0.01)低剂量组cyclin D1水平偏高,乙酸乙酯中剂量组及氯仿中、高剂量组cyclin D1相当(均P>0.05),而乙酸乙酯高剂量组cyclinD1水平则显著降低(P<0.01)。(3)氯仿及乙酸乙酯提取物对bcl-2表达的影响qPCR显示,与未加TNF-α组比较,TNF-α组bcl-2水平明显升高(P<0.01)。与TNF-α组比较,MTX组、乙酸乙酯及氯仿中、高剂量组bcl-2水平明显降低(P<0.01),昆母氯仿低、中剂量组无变化(均P>0.05)。与MTX组比较,昆母乙酸乙酯及氯仿低剂量组bcl-2水平偏高(均P<0.01),乙酸乙酯及氯仿中剂量组bcl-2变化不明显(均P>0.05),乙酸乙酯(P<0.01)及氯仿(P<0.05)高剂量组bcl-2水平则显著降低。(4)氯仿及乙酸乙酯提取物对bax表达的影响qPCR显示,与未加TNF-α组比较,TNF-α组bax水平降低(P<0.05)。与TNF-α组比较,各组bax表达水平明显升高(均P<0.01)。与MTX组比较,乙酸乙酯低剂量组bax表达相当(P>0.05),乙酸乙酯中、高剂量组及氯仿各组均明显升高(均P<0.01)。(5)氯仿及乙酸乙酯提取物对bcl-2/bax表达的影响与未加TNF-α组比较,TNF-α组bcl-2/bax升高(P<0.05)。与TNF-α组比较,各组bcl-2/bax均明显降低(均P<0.01)。与MTX组比较,乙酸乙酯低剂量组bcl-2/bax偏高(P<0.05),乙酸乙酯中剂量组及氯仿低中剂量组变化不明显(均P>0.05),乙酸乙酯及氯仿高剂量组bcl-2/bax水平明显降低(均P<0.01)。(6)氯仿及乙酸乙酯提取物对caspase-3表达的影响qPCR显示,与未加TNF-α组比较,TNF-α组caspase-3水平降低(P<0.05)。与TNF-α组比较,MTX组caspase-3升高(P<0.05)。乙酸乙酯及氯仿低剂量组无变化(均P>0.05),乙酸乙酯(均P<O.01)及氯仿(P>0.05、P<0.01)中、高剂量组升高。与MTX组比较,乙酸乙酯中、高剂量组及氯仿低、中剂量组无差异(均P>0.05),乙酸乙酯低剂量组caspase-3偏低(P>0.05)而氯仿高剂量组偏高(P>0.05)。5.昆母提取物对ERK、pERK、JNK、pJNK、P38及p-P38的影响昆母乙酸乙酯及氯仿提取物干预24h。与未加TNF-α组比较,TNF-α组p-ERK与ERK比值稍升高(P>0.05)。与TNF-α组比较,昆母乙酸乙酯低剂量组p-ERK与ERK比值变化不明显(P>0.05),中、高剂量组p-ERK与ERK比值明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)；昆母氯仿低、高剂量组p-ERK与ERK比值变化不明显(均P>0.05),中剂量组p-ERK与ERK比值明显降低(P<0.01)。与未加TNF-α组比较,TNF-α组pJNK与JNK比率升高(P<0.01)。与TNF-α组比较,昆母乙酸乙酯低剂量组及氯仿低、中剂量组比率下降(P<0.05、 P<0.01、P<0.05),昆母乙酸乙酯中、高剂量组及昆母氯仿高剂量组均偏高,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01、P<0.05)与未加TNF-α组比较,TNF-α组p-P38与P38比率升高(P<0.05)。与TNF-α组比较,昆母乙酸乙酯及氯仿提取物各组p-P38与P38比率均明显降低(均P<0.01)。结论：1.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物均能抑制RA-HFLS增殖,且抑制呈时间和浓度依赖性,时间越长,抑制率越高；浓度越大,抑制率越高。同浓度条件下,昆母氯仿、乙酸乙酯与石油醚提取物对RA-HFLS增殖的抑制作用比昆明正丁醇更强。2.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物对RA-HFLS增殖的抑制可能是通过降低Cyclin D1表达,使细胞周期G1期及S期发生阻滞实现的。3.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物可以呈浓度依赖性地使RA-HFLS发生凋亡,浓度越高,凋亡率越高。4.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物促凋亡是由多种因素共同调节的,其机制可能是降低bcl-2表达,升高bax及caspase-3表达,降低bcl-2/bax比值。5. TNF-α诱导ERK、P38及JNK磷酸化的时间可能不同。昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物可以抑制MAPK信号通路ERK、JNK、P38蛋白磷酸化。低、中、高剂量的昆母乙酸乙酯及氯仿提取物对MAPK信号转导通路的作用不同。