肺癌(Lung cancer)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均居癌症首位。仅2012年,全世界共有182万人新患肺癌,156万人死于肺癌,占据所有肿瘤相关死亡病例的19.4%。相对于南美、非洲、南亚等地区,西欧,北美和东亚的肺癌发病率更高,我国更是占据每年新发病例的1/3以上。在过去30年内,我国肺癌死亡率上升了465%,使得肺癌超越肝癌成为我国死亡率排名首位的恶性肿瘤。根据病理类型不同,肺癌通常被分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)。其中小细胞肺癌的治疗以放、化疗为主,非小细胞肺癌则强调涵盖外科手术、放疗、化疗、免疫治疗等治疗手段的综合治疗。令人遗憾的是,尽管手术方式的革新及靶向药物的应用极大的推进了肺癌治疗的进步,肺癌的总体生存率依然很低,非小细胞肺癌5年生存率只有15%左右。早期诊断手段的缺乏是肺癌低生存率的重要原因之一。因肺癌起病隐匿,早期症状不典型,患者很难在早期察觉,使得临床上绝大部分肺癌患者在初诊时已处于中晚期。因此,作为中晚期肺癌治疗的重要手段——化疗的疗效举足轻重。然而,与小细胞肺癌相比,非小细胞肺癌对传统化疗药敏感性较低。EGFR靶向药物的应用为肺癌化疗带来了新曙光,在肯定其疗效的同时,人们也逐渐认识到单靶点药物的局限性。因此,寻找新型多靶点抗肿瘤药物势在必行。天然产物以其多样化的结构和生物学活性,一直以来都是新药开发的资源库。肺癌临床上现用的一线化疗药物紫杉醇及长春碱类即分别从红豆杉和长春花中提取加工而来。大蒜素,姜黄素等天然产物也显示出良好的抗肿瘤活性。在初步筛选了不同结构的天然产物之后,我们将目光投向了提取自苔藓植物的双联苄类化合物(Bisbibenzyls)。双联苄类化合物具有抗炎,抗肿瘤,抗真菌等多种生物学活性。经过对9种双联苄类化合物的初步筛选,我们最终选取地钱素C作为我们的研究药物。本研究旨在明确地钱素C的抗肿瘤活性,阐明地钱素C诱导肺癌细胞死亡及抑制其侵袭转移的机制,并从中筛选出潜在的肿瘤标志物。第一部分地钱素C通过ROS介导的DNA损伤促进肺癌细胞凋亡的机制研究双联苄类化合物提取自苔藓植物,以其独特的结构和多样的生物学活性吸引了人们的目光。在既往的研究中,片叶苔素D,地钱素M等双联苄类化合物对前列腺癌,乳腺癌,卵巢癌等多种恶性肿瘤显示出良好的抗肿瘤活性,其抗肿瘤机制亦涵盖凋亡、自噬等不同的死亡途径。我们对地钱素C对肺癌的抗肿瘤活性进行检测并阐明其诱导肺癌细胞死亡的机制。一、地钱素C对肺癌的抗肿瘤活性检测1.地钱素C对肺癌细胞系的抑制作用：我们选用4种肺癌细胞系检测地钱素C的抑制细胞作用。MTT结果显示地钱素C对4种肺癌细胞系均显示出良好的抑制作用,半数致死量在15μM左右。2.地钱素C对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用：我们通过建立的荷瘤小鼠模型检测地钱素C的抗肿瘤作用,结果表明地钱素C可显著抑制肿瘤体积和大小,显示出良好的抗肿瘤活性。更令人欣喜的是,地钱素C并未引发小鼠体重减轻,骨髓抑制及肝功能损害,显示出地钱素C相对于传统化疗药物的优势。二、地钱素C诱导肺癌细胞凋亡的机制研究1.凋亡相关蛋白的检测：Western blot结果显示地钱素C可诱导casepase-3的活化和PARP的剪切,证实了地钱素C诱导肺癌凋亡。时相蛋白的检测显示PARP的剪切出现在12h之后,显示凋亡并非早期事件。2.ROS与DNA损伤的检测：我们对地钱素C差异表达基因芯片进行pathway分析,发现地钱素C可以高度影响DNA损伤与修复通路。与凋亡蛋白的时间点一致,地钱素C作用12h后细胞出现明显的DNA损伤；另一方面,地钱素C作用12h后细胞出现了明显的线粒体损伤,引发ROS聚积。联用ROS清除剂NAC可逆转地钱素C诱导的DNA损伤和PARP剪切,说明地钱素C通过介导ROS聚积引发的DNA损伤诱导凋亡。3. Casepase抑制剂的逆转效果检测：Casepase抑制剂zVAD-fmk仅能部分逆转地钱素C的细胞毒作用,另一方面,地钱素C诱导的肺癌细胞出现胞浆空泡化,这种形态学变化很难用凋亡来解释,提示我们除凋亡外还有其他死亡途径参与其中。第二部分地钱素C通过抑制蛋白酶体活性和抗微管作用诱导肺癌细胞旁凋亡的机制研究在第一部分中我们发现除凋亡外还有其他死亡方式参与地钱素C诱导肺癌细胞死亡的过程。我们将在这一部分探讨自噬、坏死性凋亡及旁凋亡在地钱素C诱导肺癌细胞死亡的作用并阐明其机制。一、自噬与坏死性凋亡在地钱素C诱导肺癌细胞死亡的作用1.自噬在地钱素C诱导肺癌细胞死亡过程中的作用：我们检测了自噬相关基因及相关通路蛋白的表达,发现自噬标志物LC3的表达在1小时即明显上调,而后持续上调。尽管地钱素C显著抑制自噬负调控通路AKT-mTOR通路,自噬底物p62并无明显降解揭示自噬并未发生。我们进一步使用自噬抑制剂及干扰自噬相关基因,对地钱素C诱导的胞浆空泡化和细胞死亡无逆转作用,证实自噬并非地钱素C诱导肺癌细胞死亡的死亡途径之一2.坏死性凋亡在地钱素C诱导肺癌细胞死亡过程中的作用：坏死性凋亡抑制剂Necrostatin对地钱素C诱导的胞浆空泡化和细胞死亡均无逆转作用,提示我们坏死性凋亡并非地钱素C诱导肺癌细胞死亡的死亡途径之一。二、地钱素C抑制蛋白酶体活性,诱导内质网应激1.空泡来源的鉴定：我们选用靶向不同细胞器的荧光探针对其进行标记,激光共聚焦显微镜下可清楚地显示空泡为内质网来源。而透射电镜下更加清楚地显示了地钱素C诱导的A549细胞内质网肿胀,空泡化的过程。2.内质网应激的检测：内质网应激是内质网肿胀的最常见原因。我们检测了内质网应激相关指标蛋白的表达情况。Western blot显示地钱素C可持续上调GRP78的表达,引发下游eIF2α磷酸化失活,中止大部分蛋白的转录；另一方面,ATF4等应激蛋白的表达被激活。使用放线菌酮或放线菌素D阻断蛋白合成,在缓解内质网应激的同时可显著逆转地钱素C诱导的胞浆空泡化和细胞死亡。以上结果说明内质网应激在地钱素C诱导的空泡化死亡中起关键作用。3.蛋白酶体活性的测定：蛋白酶体功能受抑导致内质网相关蛋白降解途径受阻是内质网应激的常见原因。我们发现尽管地钱素C对蛋白酶体各亚基的表达并无影响,但可显著抑制肺癌细胞蛋白酶体的胰蛋白酶样活性。因此,地钱素C与靶向另外2种蛋白酶活性的蛋白酶体抑制剂MG132在诱导细胞死亡方面表现出显著的协同作用。更重要的是,MG132可加重地钱素C胞浆空泡化的程度,再次证实蛋白酶体受抑导致的内质网应激是地钱素C诱导的空泡化死亡中的关键因素。持续性的胞浆空泡化,空泡为内质网来源,阻断蛋白合成可以逆转胞浆空泡化,以上3个旁凋亡的基本特征提示我们旁凋亡参与地钱素C诱导肺癌细胞死亡的过程。三、MAPKs不参与地钱素C诱导肺癌细胞旁凋亡我们接下来探讨与旁凋亡密切相关的ERK,p38,JNK通路在地钱素C诱导肺癌细胞旁凋亡中的作用。实验结果显示阻断ERK通路,对地钱素C诱导的胞浆空泡化和细胞死亡均无明显逆转；阻断p38通路,可部分逆转地钱素C诱导的细胞死亡,但对胞浆空泡化无明显逆转；阻断JNK通路,增加了地钱素C的细胞毒性,对胞浆空泡化同样无明显逆转。以上结果提示我们p38通路可能与地钱素C诱导的其他死亡途径(凋亡)相关,JNK通路在地钱素C诱导肺癌细胞死亡过程中起保护作用,3种MAPK通路均不参与地钱素C诱导的旁凋亡。四、LC3在地钱素C诱导肺癌细胞旁凋亡过程中起重要作用LC3的非自噬性上调是旁凋亡的一个共性。通过联用放线菌酮和内质网应激相关蛋白的干扰实验,我们证实MC诱导的持续内质网应激是LC3上调的主要原因,并确定转录因子ATF4为这一过程的关键分子。进一步的实验发现干扰LC3可显著逆转地钱素C诱导的旁凋亡,提示我们LC3在钱素C诱导旁凋亡过程中起重要作用。我们进一步确定了LC3的亚细胞定位,发现一部分LC3可直接定位于空泡膜上。而地钱素C介导的LC3过乙酰化可能是上调的LC3最终未能形成自噬泡的重要原因。五、地钱素C的抗微管作用在诱导肺癌细胞旁凋亡的过程中起重要作用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染实验证实内质网应激产生的膜泡并未运输至溶酶体降解,而芯片结果显示地钱素C可显著抑制两种微管蛋白的表达。我们推测地钱素C可能通过抑制微管阻断膜泡运输,使膜泡无法降解从而聚积融合成大空泡引发旁凋亡。western blot和免疫荧光进一步验证了芯片结果。联用抗微管药物长春碱可显著加重蛋白酶体抑制剂MG132诱导的胞浆空泡化,提示我们地钱素C的抗微管作用在其诱导旁凋亡的过程中发挥了重要作用。第三部分地钱素C通过调控RGS4表达抑制非小细胞肺癌侵袭转移的机制研究在前两部分中我们探讨了地钱素C诱导肺癌细胞死亡的机制。除不断分裂增殖之外,侵袭转移是肿瘤细胞的另一个重要的生物学活性。我们将在本部分探讨地钱素C对肺癌细胞侵袭转移能力的影响并阐明其机制。地钱素C抑制A549细胞侵袭转移Transwell体外侵袭实验表明地钱素C可显著减少肺癌细胞侵袭至下室的细胞数目。而划痕实验则显示地钱素C可显著延缓划痕愈合的进度,以上实验说明地钱素C诱导肺癌细胞死亡的同时亦可显著抑制其侵袭转移的能力。二、地钱素C上调RGS4表达1.地钱素C对CXCR4与EGFR表达无影响：为探明地钱素C抑制肺癌细胞侵袭转移的机制,我们首先检测了介导肺癌侵袭转移的主要膜受体CXCR4与EGFR的表达。结果显示地钱素C对2种受体的表达并无影响。2.RGS4在肺癌细胞系中低表达：因CXCR4与EGFR的激活均依赖于G蛋白,我们接下来关注可以负调控G蛋白偶联受体的RGS家族。有报道称RGS4的表达与乳腺癌侵袭转移相关,我们首先检测了人正常支气管上皮细胞BESA2B,人正常肺成纤维上皮细胞HFL-1,肺鳞癌细胞系SK-MES-1,肺腺癌细胞系A549,H292,H1975中RGS4蛋白表达情况。结果显示RGS4在正常肺细胞中高表达,在肺癌细胞系中低表达。3.地钱素C可显著上调RGS4的表达：我们选取了RGS4低表达的A549细胞系进行研究,结果显示尽管地钱素C对RGS4的mRNA表达水平无明显影响,但可显著上调RGS4蛋白的表达。三、过表达RGS4可下调MMPs,并逆转EMT,显著抑制A549细胞侵袭转移1.过表达RGS4可显著抑制A549细胞的侵袭转移能力：我们将pcDNA3.1-RGS4转入A549细胞过表达RGS4,划痕实验和transwell侵袭实验显示过表达RGS4可显著抑制A549细胞的转移能力和侵袭能力。2.过表达RGS4可下调MMPs并逆转EMT.我们运用pcDNA3.1-RGS4转染A549细胞后检测MMP蛋白与EMT相关指标蛋白的表达变化,结果显示过表达RGS4可显著下调A549细胞中MMP2与MMP9的表达；另一方面,E-cadherin表达下调,Vimentin表达下调。说明RGS4可通过抑制MMPs,逆转EMT,从而抑制A549细胞侵袭转移。3.过表达RGS4可阻断EGFR和CXCR4介导的侵袭转移能力增加：我们将pcDNA3.1-RGS4转入A549细胞过表达RGS4, transwell侵袭实验显示过表达RGS4可完全逆转CXCR4介导的侵袭转移能力增加,可部分逆转EGFR介导的侵袭转移能力增加,这提示我们CXCR4作为G蛋白偶联受体,可直接被RGS4负调控。四、 地钱素C通过RGS4抑制肺癌细胞侵袭转移Transwell体外侵袭实验和划痕实验显示干扰RGS4可以完全逆转地钱素C对肺癌细胞侵袭转移的抑制效果。同时western blot结果显示干扰RGS4亦可以阻断MMP2/9的下调及EMT的逆转,因此,我们得出结论：地钱素C通过上调RGS4抑制肺癌细胞侵袭转移。第四部分RGS4表达与非小细胞肺癌患者预后的相关性研究我们在第三部分中发现RGS4在肺癌细胞系与肺正常细胞系之间存在明显的表达差异,而后续实验又证实了RGS4的表达与肺癌细胞侵袭转移能力相关。这些结果提示我们RGS4具有成为肺癌新型肿瘤标志物的潜力。我们将在本部分进一步检测临床标本中RGS4的表达差异并探究RGS4的表达水平与肺癌患者相关临床指标及预后之间的关系。一、RGS4在肺癌组织中低表达我们运用免疫组化对121例非小细胞肺癌肿瘤组织切片与67例癌旁组织切片中的RGS4表达进行分析。结果显示：41.3%(50/121)的肿瘤组织中RGS4高表达,与之相对的,高达64.2%(43/67)的癌旁组织中RGS4高表达。我们从mRNA及蛋白水平检测了15对非小细胞肺癌新鲜肿瘤组织及癌旁组织中RGS4表达的差异。结果再次证实了RGS4在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达显著低于癌旁正常组织。二、RGS4表达与临床病理指标的相关性分析我们统计了121例非小细胞肺癌患者肿瘤组织切片中RGS42的表达情况及相关临床病理指标并建立数据库,运用卡方检验检测RGS4表达与临床病理指标之间的相关性。结果显示RGS4表达与淋巴结转移(P=0.009)TNM分期(P=0.008)显著相关。再次印证RGS4与肿瘤侵袭转移的相关性。三、RGS4表达与非小细胞肺癌患者预后的相关性分析1.RGS4表达与非小细胞肺癌患者5年无病生存率的相关性分析：我们运用Log-rank检验比较患者生存差别,Cox回归多因素分析判断预后因素是否独立,Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果显示RGS4低表达患者其5年无病生存率显著低于RGS4高表达患者(P=0.002),多因素分析显示RGS4是判定患者5年无病生存率的独立因素(P=0.020)2.RGS4表达与非小细胞肺癌患者5年总生存率的相关性分析：我们运用Log-rank检验比较患者生存差别,Cox回归多因素分析判断预后因素是否独立,Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果显示RGS4低表达患者其5年总生存率显著低于RGS4高表达患者(P=0.005),多因素分析显示RGS4是判定患者5年总生存率的独立因素(P=0.041)。第五部分结论及创新点一、结论1.地钱素C在体内和体外均显示良好的抗肿瘤活性。2.地钱素C通过诱导ROS聚积和DNA损伤引发肺癌细胞凋亡。3.地钱素C通过抑制蛋白酶体活性及抗微管作用诱导肺癌细胞旁凋亡。4.地钱素C通过调控RGS4表达抑制肺癌细胞侵袭转移。5.RGS4在非小细胞肺癌中低表达,可作为一个独立的负相关因素评价非小细胞肺癌的预后二、创新点与不足之处1.首次报道地钱素C诱导的细胞凋亡与ROS聚积和DNA损伤相关。2.首次报道地钱素C通过抑制蛋白酶体活性及抗微管作用诱导肺癌细胞旁凋亡。3.首次报道过表达RGS4可下调MMPs,抑制肺癌细胞侵袭转移,逆转EMT。4.首次报道RGS4作为判定非小细胞肺癌患者预后的独立因素。5.本研究主要不足之处在于地钱素C诱导肺癌细胞旁凋亡过程中LC3的作用未完全阐明,其次RGS4调控侵袭转移及EMT的具体机制尚待进一步研究。