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DFNA5是导致非综合征性耳聋的常染色体显性遗传的基因,与别的常染色体显性遗传基因的突变异质性不同,目前已知的所有致聋突变类型均为导致第八外显子跳跃的剪接位点突变。DFNA5除了与耳聋相关,还发挥抑癌基因的功能,最新的研究表明DFNA5是引发细胞继发性坏死的重要的效应蛋白。尽管对于DFNA5蛋白功能的了解越来越深入,但是关于DFNA5剪接位点突变致聋的机制尚不明确。目的:通过一个常染色体显性遗传的耳聋大家系,筛选出致病基因。通过生物信息学分析预测DFNA5蛋白的功能,构建第八外显子跳跃突变型质粒,转染不同细胞系研究DFNA5的分子功能,分析可能的致聋机制。方法:1.临床收集一个常染色体显性遗传耳聋家系,提取家系成员的外周静脉血DNA,通过全外显子捕获的方法寻找影响高频听力的的致病基因。提取该家族耳聋患者与听力正常人血样中的mRNA,逆转录PCR结合Sanger测序,验证剪切位点突变导致的mRNA改变。2.通过多序列比对工具寻找DFNA5同家族蛋白质保守性序列;用SWISS-MODEL工具预测DFNA5蛋白三级结构并推测突变型DFNA5蛋白可能的功能。3.采用基因克隆技术构建野生型与突变型DFNA5慢病毒表达载体。转染FaDu与PC12细胞,通过细胞免疫荧光的方法观察转染野生型组和突变型组细胞的形态变化以及特定蛋白质在细胞中的表达定位;通过Western Blot实验分析激活型Caspase-1和Caspase-3在转染野生型组和突变型组细胞中表达量的差异;通过qPCR实验分析DFNA5过表达细胞的生长分化相关mRNA表达水平差异。4.使用CCK-8检测细胞存活、Annexin V与PI标记细胞凋亡,确定DFNA5野生型和突变型蛋白在细胞生长和凋亡中的作用。结果：1.全外显子捕获结果显示,显性进行性耳聋家系携带致病突变DFNA5（NM001127454,c.499-1G>A）的剪接位点突变,Sanger测序验证结果表明,所有患者均携带致病基因,听力正常亲属未检出基因突变。该突变杂合致病,符合常染色体显性遗传规律。2.提取外周血RNA,执行RT-PCR,电泳检测RT-PCR产物,患者PCR产物电泳出现2条扩增带,听力正常亲属仅有单一扩增产物。进一步对RT-PCR产物进行Sanger测序,发现患者的PCR产物出现第8外显子跳跃,产生一个缺少193bp的短片段。生物信息学分析结果显示,DFNA5第8外显子跳跃导致mRNA翻译移码并提前终止,产生一个新的截短的蛋白,突变肽段位于DFNA5的C端。同源性比对发现DFNA5同族蛋白质在N端具有高度的保守性;DFNA5蛋白三级结构分析显示,DFNA5的N端与C端结构互补。3.成功构建了野生型与突变型DFNA5重组慢病毒表达载体。在转染pDFNA5mt的FaDu细胞中观察到明显的细胞凋亡,而在转染pDFNA5wt组与转染空载体组未观察到此现象,Western Blot结果表明pDFNA5mt转染组激活型Caspase-3蛋白表达量为转染野生型组的2.55倍（P<0.01）,各组均未检测到激活型Caspase-1蛋白表达。4.不同分化程度的PC12细胞转染野生型与突变型DFNA5载体,细胞免疫荧光结果未见细胞凋亡,在PC12分化组与未分化组中的转染突变型DFNA5组都观察到外源性DFNA5 mRNA表达增高,但是细胞免疫荧光实验未观察到转染成功细胞内DFNA5蛋白表达增高。结论:发现一个未被报道过的DFNA5剪接位点突变,该突变导致DFNA5基因转录时出现第八外显子跳跃,产生截短的突变蛋白。生物信息学预测突变的DFNA5蛋白可能具有细胞质膜成孔的功能。构建的突变型DFNA5慢病毒表达载体转染FaDu细胞,能够诱导细胞凋亡。野生型及突变型DFNA5蛋白对不同分化程度的PC-12细胞活性影响无差异,但突变型DFNA5转染阳性细胞mRNA水平增高,而蛋白表达未见增多,推测突变的DFNA5蛋白可能在PC12细胞内被降解。