牡丹（Paeonia suffruticosa）,芍药科芍药属宿根木本花卉,是我国的传统名花,素有“国色天香”、“花王”的美誉,具有较高的观赏和药用价值。近年来,在牡丹离体组织培养,直接再生途径方面的研究已经取得很大的进展,但仍存在牡丹试管苗生根困难、根系质量不高、移栽成活率低等问题,严重制约了离体培养下牡丹苗的快速繁殖。目前,对牡丹组织培养间接再生途径的研究主要集中在愈伤组织诱导方面,但从相关研究报道来看均尚未能建立起一套高效稳定的牡丹体胚再生体系。本研究希望通过制作石蜡切片观察牡丹种胚发育过程,并用关键期种胚进行转录组测序及探寻胚发育关键基因,以期为牡丹的体胚诱导过程和建立牡丹高效的植株再生体系提供分子生物学方面的理论和技术支撑。主要研究成果如下:1.牡丹胚发育关键期的确定本实验中通过制作石蜡切片观察到胚发育沿着原胚一球形胚一心形胚一鱼雷胚一子叶胚的发育过程完成胚发育,出现二核原胚的时间在授粉后3d-5d,在授粉后60d左右的胚珠中可观察到球形胚,心形胚出现在授粉后65d左右的胚珠中,授粉后75d的胚珠中可观察到心形胚转化为鱼雷胚,子叶胚多出现在授粉后90d左右的胚珠中。子叶胚形成之后,胚体在形状上将不再有明显变化,只是胚体不断增大。而胚发育成熟一般在授粉后130d以后,之后进入休眠状态。2.牡丹关键期种胚转录组测序本研究采用高通量测序技术,初步建立了牡丹种胚不同发育时期的转录组数据库。通过对牡丹种胚五个发育时期:原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚的15个样品进行转录组测序,一共获得了167.57 Gb的数据,组装后一共获得134,800条Unigenes,将组装得到的134,800条Unigenes进行七大功能数据库注释（KEGG、GO、NR、NT、Swiss Prot、Pfam和KOG）,最终共有82,162条Unigenes成功获得了功能注释。3.牡丹种胚发育不同时期差异基因分析通过对种胚不同时期的DEGs表达进行分析,发现球形胚与原胚期的比较中（GE/PE）,鉴定到69,986个差异表达的基因,心形胚与球形胚的比较中（HE/GE）,鉴定到38,760个差异表达的基因,鱼雷胚与心形胚的比较中（TE/HE）,鉴定到36,839个差异表达的基因,子叶胚与鱼雷胚的比较中（CE/TE）,鉴定到34,775个差异表达的基因,根据差异基因的数量分布,在从原胚发育到球形胚的过程中,较多的基因表达量发生了明显的变化,表明牡丹球形胚的形成过程中的生理活动比胚发育后期激烈,其GO功能主要富集于DNA结合、翻译、核糖体的结构组成,KEGG差异基因主要富集于核糖体通路、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖的代谢通路。心形胚的形成过程中,GO功能主要富集于DNA结合、核小体及细胞壁的形成过程,KEGG差异基因主要富集于内质网蛋白质加工、淀粉和蔗糖的代谢、植物激素信号转导及剪接体通路。鱼雷胚的形成过程中,GO功能主要富集于未折叠蛋白结合、细胞壁的形成,KEGG差异基因主要富集于内质网蛋白质加工、剪接体通路、植物激素信号转导通路。子叶胚的形成过程中,GO功能主要富集于细胞核形成过程、DNA结合、氧化还原酶活性,KEGG差异基因主要富集于内质网蛋白质加工、剪接体通路、细胞内噬作用。4.牡丹种胚发育不同时期内源激素相关基因分析内源激素影响植物的胚发育,牡丹种胚五个发育时期:原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚阶段都要受到内源激素的控制和调节。本试验中,寻找了牡丹种胚发育不同时期与内源激素IAA和ABA相关的基因片段,发现IAA相关基因片段11个,ABA相关基因片段50个。5.牡丹种胚发育不同时期抗氧化酶活性相关基因分析抗氧化酶活性与牡丹种胚的整个发育过程息息相关,胚发育过程中有众多基因与抗氧化酶活性有关。本试验中,寻找到了牡丹种胚发育不同时期与POD、SOD、APX等抗氧化酶活性相关的基因,发现与POD合成相关基因片段79个,SOD合成相关基因片段25个,APX合成相关基因片段17个。6.胚发育过程关键基因分析通过Swiss Prot注释找到了前人研究中发现的其它物种中胚发育过程中的关键基因SERK、FUS3、ABI3、AGL15、BBM以及CLV的基因片段,体细胞胚的发育途径类似于合子胚的发育,先后经历了球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期、子叶胚期等阶段,本研究希望能克隆这些种胚关键基因并为转入牡丹体胚体系做准备。以期为牡丹的体胚诱导过程及建立牡丹高效的植株再生体系提供分子生物学方面的理论和技术支撑。