牙髓干细胞(DPSCs)是一类具有良好的自我更新能力、增殖能力和多向分化能力的成体干细胞。它可以在不同条件诱导下分化成特定的细胞类型,并在牙体修复和牙齿组织再生中起重要作用。当牙齿受到龋齿、磨损、外伤等外界刺激时,牙髓中的牙髓干细胞会被激活、迁移以及分化为分泌牙本质基质的成牙本质细胞,继而矿化,形成修复性牙本质,以防止病变的进展并保护牙本质。这种修复机制一直是牙齿再生组织工程学的热点问题,因此,了解DPSCs牙本质向分化机制,寻找参与分化过程中的关键分子生物学信息,对修复性牙本质的形成和组织工程牙齿的构建具有重要意义。传统的干细胞分化研究方法主要包括免疫细胞化学、蛋白免疫印迹法、凝胶电泳等。虽然这些生物技术具有特异性强、灵敏度高等优点,但其操作步骤复杂、耗时,难以实现活细胞的无损检测。考虑到这些问题,我们引入一种原位无损、简单、快速的细胞分化监测的研究方法。伴随着纳米科技的发展,将纳米尺度材料的独特物理化学特性与特定生物分子的传感和性能调控相结合,进而发展了各种纳米探针并开发用于生物医学领域,继而推动了光电及纳米技术的发展,尤其在表面增强拉曼方面。表面增强拉曼散射(SERS)作为一种新兴的生物分析技术,能够实时监测细胞内的动态生物过程,同时提供灵敏的指纹光谱,广泛应用于细胞凋亡过程的监测、细胞pH分布等活细胞研究。本论文主要围绕牙髓干细胞牙向分化过程中的生物信息分子差异,利用光谱技术和成像技术去识别和检测牙髓干细胞在分化过程中相关调控因子,以揭示其分子作用机制。本论文的研究内容和创新点主要体现在以下几个方面:1.在这项研究中,DPSCs是从年龄在18-25岁健康成年人的第三磨牙牙髓中中提取的。采用组织块联合酶消化法分离,纯化;同时,使用免疫细胞化学、荧光及流式细胞术等方法来鉴定提取的细胞为牙髓干细胞。继而,我们运用分化药物诱导刺激干细胞,建立了DPSCs向牙本质细胞分化的细胞模型。2.分化模型建立后,我们为研究牙向分化的机制,制备了金纳米粒子(AuNPs)细胞核探针。首先,我们采用水热反应法合成了尺寸约为30 nm的AuNPs。然后,利用Au-S键的共价作用的原理,对该金纳米粒子的表面依次进行了巯基-聚乙二醇(PEG)、细胞膜穿透肽(RGD)和细胞核定位信号肽(NLS)的修饰,从而使该金纳米粒子探针具有优良的细胞核靶向性能和生物相容性。通过明场成像、暗场成像、生物电镜成像及荧光成像来表征该金纳米粒子细胞核探针的靶向定位,结果显示大部分的AuNPs都处于细胞核的内部。同时,细胞毒性检测的结果也表明,该细胞核探针对牙髓干细胞的毒性比较低。实验制备的细胞核探针对牙髓干细胞的分化没有影响,具备良好的SERS基底活性。该金纳米粒子细胞核探针的成功制备为研究牙髓干细胞的分化提供了必要的条件。3.在研究牙髓干细胞的分化过程中,我们利用制备的细胞核靶向探针作为SERS增强基底,探究了细胞核内的分子信息变化。在此研究中,采用共聚焦拉曼光谱仪对牙髓干细胞及不同分化时间段的牙本质细胞的细胞核进行表面增强拉曼光谱检测,得到了较强的SERS信号。通过免标记的单细胞SERS光谱,我们分析了牙髓干细胞向牙本质细胞分化过程中细胞核固有的SERS信号变化。结果表明在药物诱导分化刺激14天时色氨酸的含量显著增加。同时,DNA/RNA骨架的振动模式在分化过程中也发生了转变,这表明在分化过程中可能发生了DNA的复制或转录。在本论文中,我们应用药物刺激DPSCs的定向分化,并利用SERS技术对DPSCs在细胞分化过程中的分子光谱进行鉴定,确定了色氨酸可能参与了牙本质分化的过程,为牙齿组织工程提供一种可靠的分子水平的研究手段,并拓宽了分化理论的视野。