论文部分内容阅读
目的：本研究应用体外培养Wistar大鼠肺成纤维细胞，采用免疫细胞化学染色法测定细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）在肺成纤维细胞上的表达部位、RT-PCR方法测定ICAM-1mRNA表达水平，观察不同浓度IL-1β在不同时间点对肺成纤维细胞表达ICAM-1mRNA的影响。方法：采用组织切块法对大鼠胚肺成纤维细胞的培养：将Wister临产孕鼠行乙醚吸入麻醉后，立即取出Wister胎鼠，将胎鼠肺组织剪成1mm×1mm×1mm大小的小块，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基，一周左右待细胞铺满瓶底后传代，用第5~6代形态、结构一致贴壁生长的肺成纤维细胞进行实验。将实验分为三大组：(1)对照组：只应用DMEM培养液培养肺成纤维细胞6h。(2)不同浓度的IL-1β组：①应用含IL-1β（0.5ng/ml）的DMEM培养液培养肺成纤维细胞；②应用含IL-1β（5ng/ml）的DMEM培养液培养肺成纤维细胞；③应用含IL-1β（15ng/ml）的DMEM培养液培养肺成纤维细胞。以上各组均培养6h。(3)同一浓度IL-1β不同时间组：应用同样浓度IL-1β（15ng/ml）对肺成纤维细胞细胞进行不同时间（0h、2h、4h、6h、12h、24h）的培养，分为对照组、2h组、4h组、6h组、12h组、24h组。用免疫细胞化学染色法观察ICAM-1在肺成纤维细胞上的表达部位，采用RT-PCR法测定肺成纤维细胞中ICAM-1mRNA表达水平。以上各组实验重复6次。结果：1成功培养Wistar胎鼠原代肺成纤维细胞：本实验通过应用组织切块法培养Wistar胎鼠肺成纤维细胞，培养5~10h后倒置显微镜下即观察到圆形的细胞从组织块周围游走出来，经1周左右，这种圆形细胞逐渐变成椭圆、菱形，并成放射状，足变长，相邻细胞融合，互相连接，细胞核大而圆，明亮。经2~3次胰酶消化纯化后，遗留的组织块、红细胞、上皮细胞等逐渐被清除，剩下形态、结构、生长状态一致的肺成纤维细胞（细胞形态一致，胞体丰满，胞质均匀，核仁清晰，可见核分裂相，生长状况良好），为理想的肺成纤维细胞实验模型。2ICAM-1在肺成纤维细胞的表达部位正常肺成纤维细胞ICAM-1表达呈弱阳性，以胞膜为主，包浆偶有表达，胞核无表达；ICAM-1在肺成纤维细胞膜被染成棕黄色颗粒。IL-1β（15ng/mL）干预后，其胞膜的阳性颗粒颜色明显变深、增多。3RT-PCR方法测定肺成纤维细胞ICAM-1mRNA表达水平的变化各实验组在234bp处均出现了特异性的ICAM-1mRNA条带，576bp处出现了内参Rat β-actin的特异片段。ICAM-1mRNA电泳条带的光密度扫描显示，对照组ICAM-1mRNA有一定量的基础表达，但表达量甚低（0.112±0.02）。在培养液中加入不同浓度IL-1β（0.5ng/mL、5ng/mL、15ng/mL）培养6h后，ICAM-1mRNA的表达量分别为0.368±0.02、0.736±0.03、0.805±0.02，与对照组相比均明显升高（P<0.01），并且ICAM-1mRNA的表达水平随着IL-1β浓度的增加而逐渐升高，IL-1β不同浓度组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）。同一浓度IL-1β（15ng/mL）刺激下，对照组、2h组、4h组、6h组、12h组、24h组ICAM-1mRNA的表达水平分别为0.137±0.013、0.466±0.01、0.672±0.09、0.872±0.03、0.678±0.021、0.502±0.07，结果显示尽管IL-1β的浓度相同但是刺激时间不同时，ICAM-1mRNA表达水平并不相同，表现为刺激2h后出现升高（P<0.01），6h达高峰（P<0.01），8h逐渐下降趋势，随着时间的推移，未再出现进一步升高，在24h仍高于对照组。各组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论:1本实验应用组织切块培养法，成功获得了肺成纤维细胞的原代培养，此方法操作简单，成功率高，避免了胰酶消化法的过度消化，是目前获取体外培养肺成纤维细胞的较好方法之一。2ICAM-1在正常的肺成纤维细胞表达量甚低，ICAM-1主要表达于肺成纤维细胞细胞膜。3IL-1β从转录水平上调肺成纤维细胞ICAM-1蛋白的表达。4IL-1β以浓度和时间依赖的方式诱导大鼠肺成纤维细胞ICAM-1mRNA的表达增高。