【摘 要】
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蛹虫草是一种传统的药食两用真菌,其菌丝体含有多种活性成分,如虫草多糖、皂苷、腺苷、虫草素等,可作为野生虫草的替代品。食用菌的栽培存在周期长、培养条件难控制等缺陷,限制了蛹虫草的大规模生产。为满足市场需求,采用液态发酵技术生产蛹虫草受到关注。蛹虫草液态发酵过程中会产生次级代谢物皂苷,皂苷具有抗氧化、抗菌等多种生物活性,应用前景广阔。因此,本文主要进行蛹虫草液态发酵产皂苷的研究,包括研究蛹虫草液态发酵
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蛹虫草是一种传统的药食两用真菌,其菌丝体含有多种活性成分,如虫草多糖、皂苷、腺苷、虫草素等,可作为野生虫草的替代品。食用菌的栽培存在周期长、培养条件难控制等缺陷,限制了蛹虫草的大规模生产。为满足市场需求,采用液态发酵技术生产蛹虫草受到关注。蛹虫草液态发酵过程中会产生次级代谢物皂苷,皂苷具有抗氧化、抗菌等多种生物活性,应用前景广阔。因此,本文主要进行蛹虫草液态发酵产皂苷的研究,包括研究蛹虫草液态发酵产胞外皂苷的工艺条件,不同氮源调节蛹虫草合成胞外皂苷的代谢机制,蛹虫草胞外皂苷的分离纯化及其抗氧化活性等,主要结论如下:(1)通过单因素试验与响应面试验对蛹虫草液态发酵产胞外皂苷的培养基组分及配比进行优化,得到最佳培养基为木糖2.35%、蛋白胨1.18%、Cu SO4·5H2O 0.009%、VB10.002%;利用单因素试验对发酵条件进行研究,得到最佳发酵条件为培养温度25℃、转速150 r/min,接种量10%、装液量100 m L/(250 m L锥形瓶);在此条件下进行发酵,蛹虫草胞外皂苷含量达到2.22 g/L,较基础发酵工艺胞外皂苷含量提高了53.10%;利用菌种生长动力学模型拟合迅速生长期蛹虫草的生物量曲线,发现菌种的生长情况与发酵工艺条件密切相关;采用Logistic方程拟合胞外皂苷生成曲线,发现蛹虫草胞外皂苷的生长类型为生长关联型。(2)采用代谢组学研究不同氮源对蛹虫草合成胞外皂苷的影响,主成分分析(PCA)显示尿素组与蛋白胨组的代谢组有较大的差异,用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)对两组菌丝体的差异代谢物进行识别,在正离子模型中发现了差异代谢物157种,其中98种下调,59种上调,在负离子模型中发现了105种差异代谢物,其中61种下调,44种上调;尿素组与蛋白胨组的差异代谢物主要可分为以下七种类型:碳水化合物、氨基酸、脂类、核苷酸、维生素、激素和其他次级代谢产物;对七类差异代谢物的代谢途径进行分析,发现蛋白胨作为氮源在细胞中能够通过增强三羧酸循环(TCA)提高NADH和ATP的合成,从而增加蛹虫草的生物量;氨基酸(脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸)、核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、氨基嘌呤、黄嘌呤、脱氧腺苷、5-甲基胞嘧啶)、脂类(胆碱、亚油酰乙醇、磷脂酰胆碱、3-磷酸甘油、肉碱、丙酰肉碱、乙酰左旋肉碱、异柠檬酸、1,4-二磷酸肌醇)等含量的上调,表明以蛋白胨作为氮源有利于增加蛋白质、核酸及脂肪酸的合成,从而增加蛹虫草生物量和胞外皂苷的含量;脱落酸含量的下调,泛酸、烟酰胺、吡哆醇、四氢叶酸、维甲酸含量的上调,表明氮源为蛋白胨有助于增加蛹虫草生物量;咖啡甾醇水平的上调,杠柳苷元水平的下调,表明蛋白胨作为氮源可增加胞外麦角甾醇的含量。(3)先后利用大孔树脂、C18柱和DEAE-52纤维素柱对蛹虫草发酵液中胞外皂苷进行分离纯化,分别在60%乙醇溶液、20%乙醇溶液和0.3 M Na Cl溶液洗脱下得到了浓度最高的皂苷,并得到了纯度较高的皂苷化合物S;从DPPH·、·OH、O2-·的抑制及总抗氧化性四个方面对皂苷S的抗氧化性进行研究,均表明皂苷S具有较强的抗氧化活性;建立皂苷S的抗氧化动力学模型,发现皂苷在清除DPPH·、O2—·的过程中可能利用与自由基的亲和力达到清除的效果;在清除羟基自由基的反应中皂苷通过竞争性抑制达到对·OH的清除效果;皂苷在总抗氧化试验中作为抗氧化剂,提高与Fe3+-TPTZ反应的速度,是一种非竞争性抑制。
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