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轮状病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹泻和呕吐为其主要引起的典型临床症状。轮状病毒的存在,不仅严重影响畜牧业的发展,同时也威胁到人类的安全,引起严重经济损失,成为科学研究的焦点。本研究将以猪轮状病毒(Procine Rotavirus,PRV)结构蛋白VP3的C端结构域(VP3-CTD)作为主要研究对象,通过结构生物学方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD对RV的致病性有重要影响。同时,该区域还具有2’,5’-磷酸二酯酶(2’-5’PDEs)的活性,可以通过切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-oligoadenylate synthetase,OAS)合成的2’,5’-寡腺苷酸(2’-5’A)来抑制OAS-RNase L信号通路,使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使机体发病。因此,通过研究PRV VP3-CTD的结构,可以进一步了解PRV的致病和免疫逃逸的机制,为抗PRV的药物的筛选奠定基础。本研究首先对猪轮状病毒VP3-CTD基因密码子进行优化,并将VP3-CTD基因克隆到原核表达载体p ET30a上进行原核表达纯化;在原核表达过程中对含有重组载体的Rosseta(DE3)表达条件进行优化,结果表明在0.5mmol/L IPTG、18℃、180rpm/min、18h的条件下目的蛋白的可溶性良好,获得了可溶性较高的蛋白;将表达的蛋白利用Ni2+柱亲和层析和分子筛层析进行纯化,并通过超滤法得到了高浓度、高纯度、非单体形式的VP3-CTD蛋白进行后续的蛋白结晶实验的蛋白结晶实验。在蛋白结晶条件筛选方面,本研究采用坐滴法进行筛选。通过多种条件的筛选,我们发现在HR2-110试剂盒的36号条件下(0.1mo/L Tris-HCl p H 8.5,8%PEG8000)蛋白结晶状况较好,最终通过进一步的优化得到晶体生长的最佳条件为0.15mol/L Tris-HCl p H 8.3、4%PEG8000、8%EG、60 days、20℃;在该条件下蛋白可以结晶成X射线衍射较强的规则长方体晶体,其晶体大小为15μm×15μm×200μm,通过X射线衍射实验得到晶体的分辨率为2.3?,并收取数据。利用分子置换法和多种晶体分析软件进行数据分析,解析出VP3-CTD的蛋白晶体结构。通过分析表明VP3-CTD是以同源二聚体的形式存在,其单体结构主要有2个α螺旋和7个β折叠组成,C端的β折叠形成一个凹槽,该蛋白的表面静电势显示,凹槽主要带正电荷,二聚体是两分子VP3-CTD蛋白的凹槽互补嵌合的结构,中间形成一个带较强正电荷的间隙,推测其为结合和切割带负电荷的2’-5’A的区域。总之,本研究通过表达和纯化PRV的VP3-CTD蛋白,并对其进行晶体结构的解析,进一步揭示了其切割2’-5’A的结构基础,为抗PRV药物的筛选提供理论依据。