光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是一种治疗恶性肿瘤和某些良性增生性疾病的新方法。光动力疗法在对肿瘤细胞产生直接的杀伤作用同时,还可以增强宿主的抗肿瘤免疫反应。目前已有研究建立了光动力疗法制备肿瘤疫苗的方法,但对于光动力疗法制备肝癌疫苗的研究并不多见。本研究以鼠肝癌细胞MM45T-Li为研究模型,探讨利用光动力疗法制备肝癌疫苗的抗瘤效应,为肝癌的免疫治疗提供一种新的途径。目的1.探讨光动力疗法在体外对鼠肝癌细胞MM45T-Li的杀伤作用特点,以寻找光动力疗法制备疫苗的作用参数。2.分析光动力疗法制备的肿瘤疫苗对小鼠肝癌移植瘤的体内预防保护和治疗作用,比较不同光照剂量对PDT制备细胞疫苗的影响。3.探讨光动力疗法制备肿瘤细胞疫苗对小鼠体内抗肿瘤免疫反应的影响。方法1.利用荧光显微镜观察不同浓度HMME在MM45T-Li细胞中的吸收；多功能酶标仪定量分析细胞内]HMME在不同时间点的荧光强度；共聚焦显微镜观察HMME在MM45T-Li细胞中的亚细胞定位；在以]HMME为光敏剂,630nm激光为光源的PDT作用于细胞,MTT法检测光动力疗法对细胞的杀伤效应。Hoechst细胞核荧光染色法观察光动力疗法对细胞核形态的改变。AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测光动力疗法检测光动力疗法诱导的细胞凋亡。2.在功率密度为15mw/cm2的条件下,利用不同能量密度的光动力疗法作用细胞24h后提取细胞裂解液作为肿瘤疫苗。以生理盐水作为对照,反复冻融法制备的疫苗为阳性对照。疫苗免疫小鼠后建立小鼠肝癌模型,观察肿瘤体积变化。肿瘤生长至第16天,处死小鼠,称量肿瘤重量,HE染色观察肿瘤病理组织学变化。3.免疫接种结束后7d,流式细胞术检测外周血T细胞亚群的变化。同时利用阶梯密度离心法提取脾淋巴细胞,MTT法检测体外淋巴细胞毒性。4.检测疫苗的治疗作用：建立小鼠肝癌模型,疫苗免疫荷瘤小鼠,观察肿瘤体积变化。观察周期为60天,计录荷瘤小鼠生存期。结果1.细胞内HMME含量随着光敏剂浓度及孵育时间的增加而增加。选择4h孵育时间及浓度为20μg/ml的HMME作为PDT的最佳参数。共聚焦荧光显微镜显示HMME分布在细胞核外,定位于线粒体。MTT检测结果显示PDT对细胞的杀伤率随着光敏剂浓度和能量密度的增加而增加。当HMME浓度为20μg/ml,光照剂量为2.7J/cm2时,PDT对细胞的杀伤率30.21%；光照剂量为7.2J/cm2时,杀伤率达90.65%。Hoechst染色观察PDT作用24h后部分细胞出现染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变。AnnexinV/PI流式细胞术检测结果显示在能量密度为0.9至4.5J/cm2时,PDT诱导的细胞凋亡随着能量密度的增加而增加,最到达30.5±4.2%；当能量密度增加至7.2J/cm2时,细胞以坏死为主,凋亡率下降为4.1±2.7%。2.依据PDT的杀伤效果,选择能量密度为2.7和7.2J/cm2的光照剂量制备疫苗。在疫苗对荷瘤小鼠的预防保护实验中,与对照组相比,2.7J/cm2PDT组疫苗的肿瘤生长缓慢,肿瘤的体积及重量明显降低。对肿瘤体积的抑制率最高为59.8%。而大剂量7.2J/cm2PDT组中的肿瘤体积重量下降不明显。各组肿瘤的病理组织表现无明显差异。3.与对照组比较,2.7J/cm2PDT及7.2J/cm2PDT组疫苗可以明显改善机体免疫系统功能状态,逆转外周血T细胞亚群CD4+/CD8+的比值,增加NK细胞比例,同时增加脾淋巴细胞特异性细胞毒性。4.在疫苗对荷瘤小鼠的治疗实验中,2.7J/cm2PDT组疫苗的肿瘤生长缓慢,甚至消退,明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并提高荷瘤小鼠生存率。结论1. HMME介导的光动力疗法可以有效杀伤鼠肝癌细胞MM45T-Li,诱导的细胞凋亡与光照剂量密切相关。2.光动力疗法制备的肝癌细胞疫苗明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,具有预防保护和治疗作用。小剂量2.7J/cm2PDT制备疫苗的抗瘤效果优于大剂量7.2J/cm2PDT制备的疫苗。3.光动力疗法制备的肝癌细胞疫苗可以有效增强抗肿瘤免疫反应。