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兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起成年兔的一种急性、致死性、接触性传染病,以呼吸系统出血和急性肝坏死为特征,是造成养兔业巨大损失的一种重要传染病。本病于1984年首先在我国江苏省爆发,随即蔓延到世界各地。目前,免疫接种仍然是防治兔出血症的主要措施。由于RHDV没有适合培养的细胞系,现在商品化疫苗均为组织灭活苗。虽然灭活苗安全有效,但存在着成本昂贵、生物安全和动物福利等诸多缺点。因此,探索研制安全、有效、成本低廉的新型兔出血症疫苗具有现实意义。VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白和保护性抗原,在诱导抗病毒感染的免疫反应中发挥重要作用,是RHDV基因工程疫苗的首选蛋白。犬2型腺病毒(Canine adenovirus type 2,CAV2)是一种良好的病毒表达载体,具有易培养、重组病毒滴度高、外源蛋白表达量高等优点,对兔不致病,安全性好,可用于RHDV疫苗研发。本研究旨在构建表达RHDV vp60基因的E3区缺失的重组犬2型腺病毒r CAV2-VP60,并对其生长能力和遗传稳定性等生物学特性以及在兔体内的免疫效力进行评价,为研制RHDV新型病毒活载体疫苗奠定基础。本研究首先利用细菌内同源重组技术将CAV2 HLJ-10株的全基因组克隆到p Shuttle-CMV载体上,构建了含有CAV2全基因组的骨架载体p CAV2。其次,采用融合PCR方法将E3区侧翼序列(23903-24933bp和26412-28055bp)和pc DNA3.1(+)的CMV表达盒序列(232-1252bp)融合在一起,并将其克隆到p UC18载体上,构建了E3区缺失的穿梭载体p UC-ΔE3-CMV。在此基础上,将egfp基因定向克隆到穿梭载体p UC-ΔE3-CMV上,再利用穿梭载体和骨架载体共有的酶切位点Nru I和Sal I将含有egfp基因的表达盒克隆到骨架载体p CAV2上得到了重组病毒质粒p CAV2-EGFP,用特异性的内切酶Asc I酶切释放出重组基因组,转染MDCK细胞后获得了重组病毒r CAV2-EGFP。经鉴定该重组病毒能在MDCK细胞中稳定表达EGFP,一步生长曲线与亲本毒CAV2相似。这表明本研究利用p CAV2和p UC-ΔE3-CMV通过体外连接的方法构建重组犬2型腺病毒的策略是可行的,为下一步构建表达RHDV vp60基因的重组病毒r CAV2-VP60提供了技术平台。本研究利用PCR方法从质粒pc DNA-VP60中扩增出RHDV vp60基因,将其定向克隆到p UC-ΔE3-CMV中,再通过Nru I和Sal I特异性酶切位点将含有vp60基因的表达盒克隆到p CAV2中,获得了重组质粒p CAV2-VP60,用Asc I酶切释放出重组基因组后转染MDCK细胞成功拯救出重组病毒r CAV2-VP60。PCR鉴定显示vp60基因成功插入到r CAV2-VP60基因组中,将该重组病毒连续传代20次,PCR鉴定显示其具有良好的遗传稳定性;Western blot和IFA鉴定表明该重组病毒能在MDCK细胞中表达VP60蛋白,表达的VP60蛋白具有良好的抗原性;一步生长曲线表明其生长特性与亲本毒CAV2相似,病毒滴度最高可达107.5 TCID50/0.1m L。将此重组病毒r CAV2-VP60以107 TCID50/1m L接种RHDV非免疫兔,两周后加强免疫一次,同时与RHDV灭活苗和亲本毒CAV2进行免疫效果比较,结果表明r CAV2-VP60组和RHDV灭活苗组在加强免疫后1周均检测到RHDV特异性抗体,并于加强免疫后3周达到高峰,之后开始下降,攻毒后抗体又迅速升高。r CAV2-VP60组免疫兔的T淋巴细胞增殖水平和细胞因子IFN-γ、IL-4含量均高于亲本毒CAV2组。用致死剂量的RHDV HYD株滴鼻攻击后,r CAV2-VP60组和RHDV灭活苗组所有家兔均未死亡,没有出现典型的临床症状和病理变化,而亲本毒CAV2组所有家兔在攻毒后2天内全部死亡,临床症状及病理变化都很明显。综上所述,本研究成功构建了含有CAV2全基因组的骨架载体p CAV2和E3区缺失的穿梭载体p UC-ΔE3-CMV,利用此系统构建了表达RHDV vp60基因的重组病毒r CAV2-VP60,该重组病毒能在MDCK细胞中表达VP60蛋白,并具有良好的遗传稳定性,与亲本毒CAV2的生长特性相似。家兔试验表明,该重组病毒r CAV2-VP60能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫反应,免疫兔能够完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究为研制RHDV新一代病毒载体疫苗奠定了基础。