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青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,PGA,EC 3.5.1.11)能水解青霉素,产生6-氨基青霉烷酸(6-APA);而6-APA是合成多种抗菌谱广、抗菌作用强的半合成青霉素的重要原料。另外,此酶还可水解头孢菌素,用于半合成头孢菌素的重要中间体7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的生产。国内外文献表明,天然菌株的青霉素酰化酶酶活性普遍偏低,几乎没有工业应用价值。目前报道的各类菌株最高酶活力在40 U/mL,仍有很大的提升空间。本研究目的是选育高产青霉素G酰化酶的工业菌株。首先采用LiCl-紫外线复合诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)ATCC14945进行处理,获得高产青霉素的菌株12-4,并对筛选得到的高产菌株12-4进行产酶条件优化和酶分离纯化的初步探究,为工业化生产青霉素酰化酶提供更优良的菌株及产酶条件。同时采用基因工程技术、微生物分离纯化培养技术,以大肠杆菌工程菌株、土壤等为材料,进行高产青霉素酰化酶菌株的构建和筛选,为工业化生产青霉素酰化酶提供高产菌株。获得的主要研究结果如下:1.采用LiCl-紫外线复合诱变以及ARTP诱变技术先后对巨大芽孢杆菌进行诱变,NIPAB法筛选高产的菌株。实验得到高产菌株12-4,其酶活力由原菌株的4.65 U/mL提高到39.60U/mL。对工程菌株12-4生物学特征初步探究发现,诱变后的菌株菌落表面略显褶皱,β亚基表达增多,连续培养5代后菌株遗传稳定性在60%以上。对菌株12-4表达和产酶条件的优化发现,该菌株在液体培养6 h后添加终浓度为0.2%的苯乙酸,继续培养50 h后,PGA酶活力可达最大值:78.45 U/mL,比出发菌株提高了16.8倍。经过初步分离纯化,得率为64.48%。2.采用微生物分离纯化培养技术从土壤等原材料中筛选高产青霉素G酰化酶的天然微生物菌株。共得到菌株64株,其中13株菌株具有青霉素酰化酶活性,活性都比较低,活性最高的为菌株K3,其活性为:0.398 U/mL,经16s RNA鉴定,K3为不动杆菌。3.以合成的PGA基因片段为模板进行PCR,分别与载体质粒PET-HGB-HA、PET-Mbp-3C、PET-GST、PET-M-3C、PET-HGB-3C、PET-32M-3C连接。将构建成功的工程质粒分别转化表达型菌株C+并诱导表达。以PET-HGB-3C为载体的重组菌株表达活性最高,诱导表达23 h后,酶活力为41.49 U/mL。诱导表达40 h后,酶活力为58.30U/mL。