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马立克氏病(Marek′s disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)血清1型引起的鸡的一种免疫抑制性疾病,以淋巴组织增生为主要特征,具有高度传染性,给养鸡业造成严重的经济损失。目前,主要采用疫苗接种的方式来预防该病的发生。国内马立克氏病毒疫苗通常以鸡胚成纤维细胞作为制苗基质,采用滚瓶的方式进行生产。因使用SPF鸡胚成本高,原代细胞制备费时费力且易污染外源病毒等缺点,传统的疫苗制备方式已与当前利用动物细胞大规模悬浮培养病毒不相适应。为了研究更加高效的马立克氏病毒疫苗制备方法,本研究以DF-1细胞作为制苗基质来代替传统的原代鸡胚成纤维细胞,用微载体悬浮培养代替传统的玻璃滚瓶培养马立克氏病毒,从而为利用生物反应器大规模生产马立克氏病毒疫苗提供参考依据。为了确定DF-1细胞培养的最佳条件,本研究对DF-1细胞在细胞瓶中培养的复苏及冻存、细胞传代、培养基种类等条件进行了优化。结果表明,在37℃、pH7.2,使用含10%新生牛血清但不含HEPES缓冲液的DMEM/F12培养基时生长最好,在细胞传代时,按每平方厘米贴壁面积接种8×10~4-12×10~4个DF-1细胞更有利于细胞的培养。悬浮培养时,采用20r/min持续搅拌的起始搅拌方式,微载体浓度为3-7g/L、按每个微载体接种50个DF-1细胞能获得最佳的悬浮培养效果。通过细胞培养瓶中对马立克氏病毒在DF-1细胞中的培养条件进行优化,结果表明,MDV(CVI988/Rispens株)在DF-1细胞上能够良好的增殖。马立克氏病毒在DF-1细胞中最佳接毒方式为同步接毒,最佳MOI为0.02,维持液最佳换液时间为接毒后24h,最佳收毒时间为接毒后72h。微载体悬浮培养MDV(CVI988/Rispens株)的试验表明:采用同步接毒的方式,按每个微载体表面接种150-200个细胞,MOI为0.02时接种CVI988/Rispens病毒株能够取得最好的病毒培养效果。疫苗免疫保护试验表明,以DF-1细胞作为制备MDV(CVI988/Rispens株)疫苗的基质,采用微载体悬浮培养技术制备的MDV(CVI988/Rispens株)疫苗对SPF鸡进行免疫,免疫后5 d对鸡只进行MDV超强毒株Md5株攻毒。结果显示,以DF-1细胞悬浮培养制备的MDV疫苗能够取得与商品疫苗CVI988/Rispens株相当的保护效率,达到90%以上。疫苗免疫不会对鸡的生长状况、体重以及免疫器官造成明显的影响。本研究利用DF-1细胞代替原代鸡胚成纤维细胞,采用细胞搅拌瓶和微载体悬浮培养MDV,为MDV疫苗和其他生物制品的大规模生产开辟了一条新途径,而且更加符合现代生物制品行业发展的趋势,具有较大的理论意义和实用价值。